E*****s
发帖数: 39 | 1 我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
因呢？
我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。 |
r***e
发帖数: 2539 | 2 主要是蛋白半衰期太长（PCR有效，WB不行），
另外可能蛋白抑制后，生长劣势（PCR， WB都不行），或者shRNA序列不行。
【在 E*****s 的大作中提到】
: 我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
: 50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
: 因呢？
: 我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
: 稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
: 是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
: 新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。
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E*****s
发帖数: 39 | |
a*****x
发帖数: 901 | 4 Try longer knock-down (6 days or more) |
m*****z
发帖数: 1451 | 5 shrna效率太低，换一个试试。另外蛋白太稳定，你用的transient还是lentivirus？
【在 E*****s 的大作中提到】
: 我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
: 50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
: 因呢？
: 我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
: 稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
: 是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
: 新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。
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E*****s
发帖数: 39 | 6 不是lentivirus，但也不是transient，只是转染48小时后，细胞重新稀释传代，换含
有puromycin的培养基筛选。
现在真是头痛阿，之前用试过三种siRNA，也是没用，真是郁闷。
【在 m*****z 的大作中提到】
: shrna效率太低，换一个试试。另外蛋白太稳定，你用的transient还是lentivirus？
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m*****z
发帖数: 1451 | 7 那你用的什么approach
【在 E*****s 的大作中提到】
: 不是lentivirus，但也不是transient，只是转染48小时后，细胞重新稀释传代，换含
: 有puromycin的培养基筛选。
: 现在真是头痛阿，之前用试过三种siRNA，也是没用，真是郁闷。
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b****s
发帖数: 148 | 8 increase MOI
try harvest protein as early as possible, eg. 48hrs post-puromycin selection
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b**********8
发帖数: 349 | 9 也可以考虑换一个抗体试试。
我就在自己的project中发现，转导lentivirus shRNA后，qRT-PCR能看到70%以上的
knockdown，但是western没差。后来买了个识别C-terminus的抗体就能看到很明显的差
异（之前用的是识别N-terminus的抗体）。至今仍不解这是为什么，有大侠解释下么？ |
l****j
发帖数: 70 | 10 是不是C-termi为功能区？
【在 b**********8 的大作中提到】
: 也可以考虑换一个抗体试试。
: 我就在自己的project中发现，转导lentivirus shRNA后，qRT-PCR能看到70%以上的
: knockdown，但是western没差。后来买了个识别C-terminus的抗体就能看到很明显的差
: 异（之前用的是识别N-terminus的抗体）。至今仍不解这是为什么，有大侠解释下么？
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 LZ pls try long hairpin RNA (lhRNA)
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
its pp130 left column
Functional screening using lhRNA expression libraries also appears to
be more efficient than using shRNA expression libraries for these
organisms.
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114
【在 E*****s 的大作中提到】
: 不是lentivirus，但也不是transient，只是转染48小时后，细胞重新稀释传代，换含
: 有puromycin的培养基筛选。
: 现在真是头痛阿，之前用试过三种siRNA，也是没用，真是郁闷。
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