e****s
发帖数: 1125 | 1 加DTT或者TCEP有什么不好吗？
既然在DTT/TCEP的条件下稳定，就这么提啊。我们实验室提取蛋白一般Buffer都放1-
5mM DTT。如果DTT对下游试验会有干扰，用以前脱盐或者Dialysis就好了。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 2 Many thanks.
Will 5mM TCEP is sufficient to last for one month? I use 1 mM at room
temperature for a week by now and the protein is still happy by far.
I use neutralized TCEP solution, so pH would not be an issue.
setup
prevented |
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k******0
发帖数: 1073 | 3 试图纯化protein phosphatase PP1 复合体，蛋白质在1mM DTT （含Mn离子），但过了
3，4天，蛋白质开始沉淀，此时加入更多DTT，蛋白质又稳定了。发现Pp1有13个
cysteine，没有双硫键，可能是这些cysteine crosslink蛋白质。
TCEP可以保持蛋白质更长时间。尝试5mM，不知蛋白质能稳定几天。正在检测中。
有没有xdjm有纯化PP1的经验，如何克服这氧化的问题？是否可以alkylate 这些
cysteine？ 多谢解答。 |
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b******y
发帖数: 627 | 4 DTT and BME are intrinsically unstable in aqueous solution. They will die
out within days. Use TCEP as it is more stable. After crystal trial is setup
, the system will be isolated in terms of O2. Further oxidation is prevented
. If you use high concentration of TECP, make sure to pH it right as it is
very acidic. |
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c*********d
发帖数: 9770 | 5 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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m**z
发帖数: 787 | 6 try to run the Ni-column with TCEP in the buffer. TCEP should not interfere
with the Ni-column and can protect the Cys residues. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 8 DTT 和B-ME都是起还原作用。防止2硫键。 但是各有优缺点。 DTT在室温和4oC都不稳
定。 大概有效时间是1天。 b-
ME稳定，但是还原能力比DTT弱。 DTT和b-ME都很难闻。 现在有的实验室用TCEP. 还原
能力强，又稳定无色无味。 但
是价格高。 所以都是随个人喜好和经济实力来选择。
这是为什么呢？
相取消了吗。EDTA的目的是什么 |
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g*****p
发帖数: 451 | 9 这个基本上不太可能是蛋白表达时生成的(如果你真的发现蛋白间有二硫键的话）
E.coli在细胞胞质里有thioredoxin,glutathione等还原系统
除非你的蛋白是membrane protein或者secret 到periplasm才会有DsbG等系统把二硫键
形成
如果是因为aging形成的缘故，加0.1-0.5mM TCEP/1 mM DTT/5-10mM belta
mercaptoethanol
(价格由高到低）就可以了 |
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J********n
发帖数: 534 | 10 是不是Se-Met置换会导致蛋白溶解度降低?
不一定。not necessarily.
另外是不是Se-Met容易被氧化,需要用什么措施来保护?
我自己从来没有遇到过，不过看到有过这类的paper。如果是intracellular蛋白，没有
二硫键的，加点TCEP或者b-Me就好。 |
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p**5
发帖数: 2544 | 11 I want to use tcep, which is stabler and less buffer issues. |
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m**z
发帖数: 787 | 12 best solution is to remove oxygen by dialyzing the protein in an anaerobic
chamber with buffers free of oxygen.This is not easy to do though. |
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k******0
发帖数: 1073 | 13 没有不好，我只是想蛋白质能够稳定更长时间，在金属离子存在的情况下DTT很快就被
氧化了。蛋白质氧化了引起聚集沉淀。
蛋白质在结晶过程不好不断加还原剂。 |
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b******y
发帖数: 627 | 15 If they are in well capped tubes, sufficient. may even afford to use less,
for instance 1 or 2 mM. good luck. |
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b******y
发帖数: 627 | 16 If they are in well capped tubes, sufficient. may even afford to use less,
for instance 1 or 2 mM. good luck. |
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k******0
发帖数: 1073 | 17 I wanted to purify a protein, which is only stable for a couple day in DTT
and then started aggregation when DTT died out. How to prevent this, except
the change of DTT for TCEP? |
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B***Q
发帖数: 182 | 18 keep it anaerobically in the presence of DTT or TCEP? |
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c********b
发帖数: 363 | 20 印象中BME还不如DTT稳定吧，TCEP似乎是最好的选择，如果想反复冻融。 |
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w*****8
发帖数: 193 | 21 我的TEV里的reducing reagent是TCEP，而且也只有0.5mM，这个浓度够不够？ |
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t*******o
发帖数: 516 | 22 我也是做结晶的。 你这种情况多半是溶液不对。所谓高盐是相对TEV酶切的。比如
500mM盐。 你得先保证你的蛋白稳定了才能谈其他的对不对。楼上说的加DTT估计也有
帮助。0.5mM TCEP还是弱了点。
再说了，谁说高一点的盐不能结晶的？最普通的做法就是，screening时，set up好
droplet后，密封前，在所有的well solution里补加等浓度的盐，比如500mM. |
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p****g
发帖数: 5 | 23 想把ubiquitin通过C端连接到另外一个protein上。把ubiquitin的C端loop最后一个残
基突变成了Cystein，把目标蛋白表面也突变了一个地方成Cysteine。
都是带His-tag，用镍柱纯化，纯化的时候都用了TCEP。到最后把两个蛋白都换进一个
没有还原剂的buffer，然后dialyse 过夜。结果每次都发现cysteine活性很低，只有少
数的目标蛋白连上了ubiquitin。更不解的是ubiquitin自己应该很容易形成di-
ubiquitin，但这个形成的都不多。
各位前辈有没有过这方面的经验，能不能提供一些建议？多谢多谢
（我想到的是Cysteine已经被提前切掉了。或者被氧化成了非二硫键的氧化产物，比如
sulfinic acid...） |
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u***l
发帖数: 2997 | 24 可能是形成二硫键了。溶液除氧了么？Thioamide可以异构化，双键移到氮上，变成烯
胺上接一个巯基。有氧的情况下，可以自身成二硫键，也可以和DTT成二硫键。加点
TCEP试试。 |
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