b******s
发帖数: 5365 | 1 老板想叫我接着实验室里一个学生做的课题，但听说她做的这个蛋白只能从一个方向被
pulldown，换了bait和pray后就不行。我想知道除了假阳性外可能有其他什么原因吗？
能做的是膜蛋白把细胞内蛋白IP下来，相反就不行-----会不会是lysis buffer不能很
好地分离膜蛋白的问题？但是这个蛋白只有一个transmembrane domain，按理应该不成
问题的啊。 |
i*******n
发帖数: 48 | 2 姑且定义bait是membrane protein A， Prey是cytosol protein B
多种可能性
1.假阳性
2.细胞内蛋白B比较abundant,而膜蛋白A比较少。
如果是这种情况，跑western的时候减少input的量，增加IP的量，也许能看到。
3.prey蛋白B抗体识别的antigen region可能是bait A的binding region，导致你用
B的抗体IP下来的只能是不结合A的那部分。
如果是这种情况，给B加个tag或者换个抗体试一试。
【在 b******s 的大作中提到】
: 老板想叫我接着实验室里一个学生做的课题，但听说她做的这个蛋白只能从一个方向被
: pulldown，换了bait和pray后就不行。我想知道除了假阳性外可能有其他什么原因吗？
: 能做的是膜蛋白把细胞内蛋白IP下来，相反就不行-----会不会是lysis buffer不能很
: 好地分离膜蛋白的问题？但是这个蛋白只有一个transmembrane domain，按理应该不成
: 问题的啊。
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s******y
发帖数: 28562 | 3 除了你说的这两种可能，我再补充几个：
1。 胞内蛋白B能结合非常多的其他蛋白，不是专一结合A的，所以如果用B的话，
拉下来的蛋白大多是其他蛋白，A的信号会很弱。
2。native 膜蛋白在处理的时候容易进入aggregate 状态而很难被结合起来。
3。native 膜蛋白不被激活的时候就不结合胞内蛋白B。
比方说我们都知道膜蛋白cadherin 能够结合beta-catenin， 用GST-cadherin-tail
也很容易就能把beta-catenin 拉下来。 但是如果要倒过来用beta-catenin来拉
native cadherin （不是GST-cadherin tail)的话就很难做。我自己曾经试过一次
就没有做出来。后来请问了一个大牛实验室的人，他说这个就是很难做的。
我建议楼主，假如真的需要重复的话，要么就用那个人造的tagged A fragment 来
做，要么就用其他方法（比方说FRET)来重复。
【在 i*******n 的大作中提到】
: 姑且定义bait是membrane protein A， Prey是cytosol protein B
: 多种可能性
: 1.假阳性
: 2.细胞内蛋白B比较abundant,而膜蛋白A比较少。
: 如果是这种情况，跑western的时候减少input的量，增加IP的量，也许能看到。
: 3.prey蛋白B抗体识别的antigen region可能是bait A的binding region，导致你用
: B的抗体IP下来的只能是不结合A的那部分。
: 如果是这种情况，给B加个tag或者换个抗体试一试。
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b******y
发帖数: 627 | 4 根据上面两位的，我再补充一点。有时，A 可拉 B 但 B 不可拉 A 是因为valence
issue. For example, if A is a monomer and B is a dimer or oligomer, Ab(A) is
a high affinity dimer towards A and make an A dimer. Dimeric A will
interact with oligomeric B at high affinity. Ab(B) binding to B, however,
doesn't increase the affinity with monomeric A and therefore it is hard to
pull it out in the direction.
In addition, more interactions are of low affinity than those of high ones
in the cell. Unfortunately low affinity ones are understudied. |
b******s
发帖数: 5365 | 5 很精彩的讨论啊，学习了！谢谢各位牛牛！
Sunnyday: 知道了cytosolic protein B和membrane protein A的binding region的情
况下，那么用tagged B binding region应该可以克服B和其他蛋白作用而导致IP A信号
弱的问题了吧？这个和你说的tagged A fragment IP B是一样的，可以算个反向IP.
关于FRET，这个能做出来当然非常好，而且可以证明是直接binding了，不过我对这个
assay一直是心存敬畏啊。如果已经有optimised 好的系统那还好，要是要从头
optimise的话，可能会很悲催。我知道有个phd student 花了4年时间来做FRET,文章是
发了，通篇就是FRET，但觉得很risky啊。 |
s******y
发帖数: 28562 | 6
可以试试看，但是不要把宝压在上面就好了
是比较tricky, 但也是能做出来的，关键就看有没有这个必要。
【在 b******s 的大作中提到】
: 很精彩的讨论啊，学习了！谢谢各位牛牛！
: Sunnyday: 知道了cytosolic protein B和membrane protein A的binding region的情
: 况下，那么用tagged B binding region应该可以克服B和其他蛋白作用而导致IP A信号
: 弱的问题了吧？这个和你说的tagged A fragment IP B是一样的，可以算个反向IP.
: 关于FRET，这个能做出来当然非常好，而且可以证明是直接binding了，不过我对这个
: assay一直是心存敬畏啊。如果已经有optimised 好的系统那还好，要是要从头
: optimise的话，可能会很悲催。我知道有个phd student 花了4年时间来做FRET,文章是
: 发了，通篇就是FRET，但觉得很risky啊。
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i*****g
发帖数: 11893 | 7 用数学wsn的说法，大概是 bi-directional interactions masked and become
directional after operation |
b******s
发帖数: 5365 | 8 科普一下展开说说？
【在 i*****g 的大作中提到】
: 用数学wsn的说法，大概是 bi-directional interactions masked and become
: directional after operation
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