x*****a
发帖数: 972 | 1 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
。我想测刺激
前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
reliable的吧。
我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
定量比较（不
知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
请高手指点。 |
z*******a
发帖数: 175 | 2 seems the other way around |
x*****a
发帖数: 972 | |
b*****l
发帖数: 9499 | 4 为啥不 elisa 涅？
【在 x*****a 的大作中提到】
: 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
: endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
: 。我想测刺激
: 前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
: 这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
: reliable的吧。
: 我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
: 定量比较（不
: 知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
: 请高手指点。
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w*****n
发帖数: 310 | 5 2%哪个方法都不太好.
【在 x*****a 的大作中提到】
: 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
: endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
: 。我想测刺激
: 前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
: 这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
: reliable的吧。
: 我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
: 定量比较（不
: 知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
: 请高手指点。
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p****l
发帖数: 291 | 6 eNOS? 这个细胞内表达的，用flow要intracellular staining,但不是不可以操作，即
便10万细胞也足够了。如果只增加2%，你control要做好，否则很难判断的。
westernblot应该更灵敏一些
另外你可以用confocal，组化染eNOS和细胞核，应该也可以捕捉到阳性信号。
其实你可以qPCR的。
【在 x*****a 的大作中提到】
: 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
: endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
: 。我想测刺激
: 前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
: 这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
: reliable的吧。
: 我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
: 定量比较（不
: 知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
: 请高手指点。
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x*****a
发帖数: 972 | 7 confocal那个只能确定是否表达的吧，但是没法量化的比较是否增加。
intracellular staining我以前试过另一个protein，也还能做到。
western是比较band的gray scale的强度？我不太懂western的。
谢谢了啊
【在 p****l 的大作中提到】
: eNOS? 这个细胞内表达的，用flow要intracellular staining,但不是不可以操作，即
: 便10万细胞也足够了。如果只增加2%，你control要做好，否则很难判断的。
: westernblot应该更灵敏一些
: 另外你可以用confocal，组化染eNOS和细胞核，应该也可以捕捉到阳性信号。
: 其实你可以qPCR的。
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Z**********g
发帖数: 222 | 8 qPCR不是挺合适的吗?2%对于western有点够呛吧.Flow的话,要是你能够再使用一种
marker以区分muscle和endothelial cells,也不错.另外,flow不仅可以知道蛋白的总体
增加量,而且还可以知道有多少细胞增加了该蛋白.
【在 x*****a 的大作中提到】
: 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
: endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
: 。我想测刺激
: 前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
: 这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
: reliable的吧。
: 我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
: 定量比较（不
: 知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
: 请高手指点。
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x*****a
发帖数: 972 | 9 最好的情况是直接测nitric oxide的产生量，我用ELISA试过，不行，太低了，虽然有
读数，但是我
觉得不reliable。
退而求其次就是看eNOS的表达。qPCR是看基因的增加的吧，基因的增加不代表蛋白也会
增加，这个没错
吧？所以我偏好直接测蛋白的含量。
我可以用CD31把endothelial cells隔离出来，这个不难；然后在这个sub-population
里再比较
看eNOS的表达是否有变化。我是担心muscle cell在western blot中会带来noise，掩盖
了eNOS
的信号。
“还可以知道有多少细胞增加了该蛋白”，这个，能说说怎么做么？谢谢啊
【在 Z**********g 的大作中提到】
: qPCR不是挺合适的吗?2%对于western有点够呛吧.Flow的话,要是你能够再使用一种
: marker以区分muscle和endothelial cells,也不错.另外,flow不仅可以知道蛋白的总体
: 增加量,而且还可以知道有多少细胞增加了该蛋白.
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Z**********g
发帖数: 222 | 10 Flow的基本功能不就是细胞计数吗?比如你把10万个细胞上机,根据机器检测的每个细胞
荧光信号,就可以得到阳性(eNOS增加)和阴性(eNOS不变)细胞的数量或百分比了.当
然如果你的endothelial细胞很均一,可能所有细胞的eNOS都增加了.至于eNOS总体含量
的变化,估计就是比较处理前后两组细胞的总体荧光平均值吧.
population
【在 x*****a 的大作中提到】
: 最好的情况是直接测nitric oxide的产生量，我用ELISA试过，不行，太低了，虽然有
: 读数，但是我
: 觉得不reliable。
: 退而求其次就是看eNOS的表达。qPCR是看基因的增加的吧，基因的增加不代表蛋白也会
: 增加，这个没错
: 吧？所以我偏好直接测蛋白的含量。
: 我可以用CD31把endothelial cells隔离出来，这个不难；然后在这个sub-population
: 里再比较
: 看eNOS的表达是否有变化。我是担心muscle cell在western blot中会带来noise，掩盖
: 了eNOS
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p****l
发帖数: 291 | 11 测NO用Invitrogen的kit
测蛋白采用ELISA呢
qPCR可以作为fig用的，如果你想看处理前后这个gene表达的变化，或者不同细胞之间
比较
你既然可以CD31去定义内皮细胞，那么就sort出来，再western blot就不会有muscle
cell干扰了
population
【在 x*****a 的大作中提到】
: 最好的情况是直接测nitric oxide的产生量，我用ELISA试过，不行，太低了，虽然有
: 读数，但是我
: 觉得不reliable。
: 退而求其次就是看eNOS的表达。qPCR是看基因的增加的吧，基因的增加不代表蛋白也会
: 增加，这个没错
: 吧？所以我偏好直接测蛋白的含量。
: 我可以用CD31把endothelial cells隔离出来，这个不难；然后在这个sub-population
: 里再比较
: 看eNOS的表达是否有变化。我是担心muscle cell在western blot中会带来noise，掩盖
: 了eNOS
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p****l
发帖数: 291 | 12 细胞内染色，2%，而且他不太确定阳性信号有多强，不一定可以得到很可靠的结果的
处理过程中会有损失的，最后上机的不足10万，这个数量不是问题
200个细胞flow也足够
【在 Z**********g 的大作中提到】
: Flow的基本功能不就是细胞计数吗?比如你把10万个细胞上机,根据机器检测的每个细胞
: 荧光信号,就可以得到阳性(eNOS增加)和阴性(eNOS不变)细胞的数量或百分比了.当
: 然如果你的endothelial细胞很均一,可能所有细胞的eNOS都增加了.至于eNOS总体含量
: 的变化,估计就是比较处理前后两组细胞的总体荧光平均值吧.
:
: population
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w****l
发帖数: 535 | 13 2%啥也看不出来啊，上样都有10%的误差
【在 x*****a 的大作中提到】
: 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
: endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
: 。我想测刺激
: 前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
: 这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
: reliable的吧。
: 我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
: 定量比较（不
: 知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
: 请高手指点。
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w****l
发帖数: 535 | 14 不管那种方法，都要有好的antibody
western最好做，可以先试一下,一目了然，先优化一下antibody的dilution
western检测不出来，试试regular fluorescent microscopy看一下，确认一下
antibody
work,work了做flow比confocal容易
ELISA或者MSD如果有卖的kit可以直接买来试，
要没有需要自己coat plate的话，那就最后试吧，因为需要一对好的antibody,
优化起来最麻烦
population
【在 x*****a 的大作中提到】
: 最好的情况是直接测nitric oxide的产生量，我用ELISA试过，不行，太低了，虽然有
: 读数，但是我
: 觉得不reliable。
: 退而求其次就是看eNOS的表达。qPCR是看基因的增加的吧，基因的增加不代表蛋白也会
: 增加，这个没错
: 吧？所以我偏好直接测蛋白的含量。
: 我可以用CD31把endothelial cells隔离出来，这个不难；然后在这个sub-population
: 里再比较
: 看eNOS的表达是否有变化。我是担心muscle cell在western blot中会带来noise，掩盖
: 了eNOS
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t*d
发帖数: 1290 | 15 如果增加只是2%，还是不要费事了。早放手早解脱。
【在 x*****a 的大作中提到】
: 我想测一个muscle/endothelial cell的体系中nitric oxide synthase的表达（只有
: endothelial表达）。细胞数量很少，大约10万，所以synthase的表达估计信号也很弱
: 。我想测刺激
: 前和刺激后的synthase的表达是否有变化，我估计就算有也非常小。
: 这种情况下，是不是用flow会更好一点？比如如果增加只是2%，flow的结果会比较
: reliable的吧。
: 我不是很熟western。但是我觉得western对于蛋白表达量要比较高才能看到，而且不能
: 定量比较（不
: 知道对不对？），尤其是量差很小的时候，容易被noise掩盖。
: 请高手指点。
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x*****a
发帖数: 972 | 16 用western blot，测的是全部population的蛋白含量。但是如果每个细胞的蛋白含量不
一致，特别是刺激前后的变化不一致（这非常可能的吧），那我用flow测每个细胞的变
化，然后做统计处理，这样更能接近真实情况的吧。
sort的话，会损失很多细胞的吧。
而且我主要是觉得muscle cells会产生干扰，也许很低，也许很高；如果用flow，可以
很容易看出是否有干扰，以及干扰到什么程度。
不知道我的思路，对么？ |
w****l
发帖数: 535 | 17 你要是有能做flow的antibody就做flow呗
做western,load equal volume,不要load equal amount of protein.
有好antibody的情况下，当然prefer flow,不过flow比western更挑antibodys
sort完全没必要，直接gateCD 31+ popluation就行了
【在 x*****a 的大作中提到】
: 用western blot，测的是全部population的蛋白含量。但是如果每个细胞的蛋白含量不
: 一致，特别是刺激前后的变化不一致（这非常可能的吧），那我用flow测每个细胞的变
: 化，然后做统计处理，这样更能接近真实情况的吧。
: sort的话，会损失很多细胞的吧。
: 而且我主要是觉得muscle cells会产生干扰，也许很低，也许很高；如果用flow，可以
: 很容易看出是否有干扰，以及干扰到什么程度。
: 不知道我的思路，对么？
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D*a
发帖数: 6830 | 18 你咋知道是2%的？就算是2%， 就能解释你的现象么？ |
c******r
发帖数: 3778 | 19 真的是2%？？？
还是算了吧，绝大多数生物实验的误差都远大于2% |
m*******1
发帖数: 58 | 20 顺便问一下:
测定一个细胞内蛋白的磷酸化, flow和western哪个更加准确?
一般两者定量结果一致性如何?
我看临床诊断好像偏爱flow? 为什么? 容易定量?
flow和western的precision(%CV)一般由多大? 10%?
谢谢 |
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c******r
发帖数: 3778 | 21 western定性还可以，定量很扯的。
【在 m*******1 的大作中提到】
: 顺便问一下:
: 测定一个细胞内蛋白的磷酸化, flow和western哪个更加准确?
: 一般两者定量结果一致性如何?
: 我看临床诊断好像偏爱flow? 为什么? 容易定量?
: flow和western的precision(%CV)一般由多大? 10%?
: 谢谢
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w****l
发帖数: 535 | 22 western is only semi-quantitative, you have to have standard to be
quantitative.
For flow, you could use beads.
【在 m*******1 的大作中提到】
: 顺便问一下:
: 测定一个细胞内蛋白的磷酸化, flow和western哪个更加准确?
: 一般两者定量结果一致性如何?
: 我看临床诊断好像偏爱flow? 为什么? 容易定量?
: flow和western的precision(%CV)一般由多大? 10%?
: 谢谢
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y******8
发帖数: 1764 | 23 the cost of FACS could be 10 times higher than WB or IHC. |
x*****a
发帖数: 972 | 24 2%只是我的预测，我也不知道多少，但是我预估不会很大。
如果我用flow，正如前边一个朋友说的，一个sample里面成千上万的细胞，这么大的
sample space，即便是很小的difference也能显现出来；用western，要是就n=3，那就
瞎了，n=1万，也不现实啊。 |
