y********g
发帖数: 782 | 1 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
大家有protocol可以share一下吗？
我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
很崩溃~~
求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~ |
C*****h
发帖数: 926 | 2 抗体可能有问题。
先做个western blot再说。
1ug
【在 y********g 的大作中提到】
: 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
: 大家有protocol可以share一下吗？
: 我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
: 看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
: 几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
: 另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
: 的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
: 很崩溃~~
: 求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~
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s**a
发帖数: 293 | 3 也许内源表达太低测不到……全细胞裂解液的 positive control 有没有条带？
没的话换用高灵敏度的发光底物试试
1ug
【在 y********g 的大作中提到】
: 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
: 大家有protocol可以share一下吗？
: 我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
: 看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
: 几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
: 另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
: 的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
: 很崩溃~~
: 求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~
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c********r
发帖数: 189 | |
A******y
发帖数: 2041 | 5 You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
native IP. |
s***a
发帖数: 671 | 6 用light-chain specific的二抗可以解决你IgG的背景问题。
1ug
【在 y********g 的大作中提到】
: 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
: 大家有protocol可以share一下吗？
: 我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
: 看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
: 几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
: 另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
: 的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
: 很崩溃~~
: 求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~
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a****l
发帖数: 125 | 7 why use T-25? T-25 is not very big, so there are not too many cells. why don
't use T-75?
for
【在 A******y 的大作中提到】
: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.
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y********g
发帖数: 782 | 8 全细胞裂解液有条带，western 也是work了~~ 主要还是2个问题，最主要的一个还是背
景太高。 我用抗mouse的pull down，用抗兔的蛋白检测，还是很多的背景杂带~~~
大家beads是怎么clear的？
我看protocol 通常有3种
1）先加Beads到样品中，然后把上清移到另一个管子里，然后再加beads和抗体过夜。
2）先将Beads和裂解液（不是样品）混合，rotate 1h，然后再离心，把preclear的
Beads+抗体+样品液 混在一起4度过夜。
3）将抗体和样品4度过夜，然后把Beads加进去，4度转4h左右。
3种方法，哪种背景更少啊，还是说差不多？谢谢大家了 |
A******y
发帖数: 2041 | 9 You can use a T-75. It's easy for me because I have too many conditions and
it works at that amount of cells (I have lymphocyte, too). There are some
pull down require minimum of T75 or larger.
don
【在 a****l 的大作中提到】
: why use T-25? T-25 is not very big, so there are not too many cells. why don
: 't use T-75?
:
: for
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c********b
发帖数: 363 | 10 不要用二抗，用protein a-hrp会好些
【在 y********g 的大作中提到】
: 全细胞裂解液有条带，western 也是work了~~ 主要还是2个问题，最主要的一个还是背
: 景太高。 我用抗mouse的pull down，用抗兔的蛋白检测，还是很多的背景杂带~~~
: 大家beads是怎么clear的？
: 我看protocol 通常有3种
: 1）先加Beads到样品中，然后把上清移到另一个管子里，然后再加beads和抗体过夜。
: 2）先将Beads和裂解液（不是样品）混合，rotate 1h，然后再离心，把preclear的
: Beads+抗体+样品液 混在一起4度过夜。
: 3）将抗体和样品4度过夜，然后把Beads加进去，4度转4h左右。
: 3种方法，哪种背景更少啊，还是说差不多？谢谢大家了
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g**********r
发帖数: 605 | 11 正解！
for
【在 A******y 的大作中提到】
: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.
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n****n
发帖数: 434 | 12 there are too many answers to the problem:
1. cell types (find a higher expression cell type or line)
2. antibody quality (antibody are NOT universal, being good for western does
not mean good for IP. if the antibody was never tested for IP, you can try
dilution factor/incubation time. use of transfected lane as control will
help [can you IP your transfected target using both your antibody and anti-
TAG?]. try different antibody from different source)
3. your IP skills (by no means i look down at you。IP sounds easy, but......
I dont need to elaborate).
4. ...... (具体问题具体分析) |
i**********a
发帖数: 1402 | 13 一般就是抗体的问题，或者是buffer的问题。换个抗体试试。 |
a****l
发帖数: 125 | 14 再请教一个, 100ug 的抗体是不是太多了? 算起来要上百 ul 的抗体....
for
【在 A******y 的大作中提到】
: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.
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L*******e
发帖数: 2153 | 15 yep! this is the right way~
for
【在 A******y 的大作中提到】
: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.
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