m******h
发帖数: 32 | 1 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
50Aa的柔性linker连接。
结果我杯具了：
1，蛋白表达量急剧下降。
2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
但是两个颜色的荧光还都能看见。
目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！ |
w**********s
发帖数: 72 | 2 试试不同的linker。 以前也作融合蛋白，遇到类似的问题，试了不同的linker就没事
了。
定位和
【在 m******h 的大作中提到】
: 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
: 功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
: 50Aa的柔性linker连接。
: 结果我杯具了：
: 1，蛋白表达量急剧下降。
: 2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
: 但是两个颜色的荧光还都能看见。
: 目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！
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y***n
发帖数: 11261 | 3 换一个rigid的linker试试？
定位和
【在 m******h 的大作中提到】
: 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
: 功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
: 50Aa的柔性linker连接。
: 结果我杯具了：
: 1，蛋白表达量急剧下降。
: 2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
: 但是两个颜色的荧光还都能看见。
: 目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！
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m******h
发帖数: 32 | 4 谢谢楼上的建议，我也是这个思路，目前也只能是这么试试看，看改变一下linker的长
度和氨基酸序列吧。
另外，不知道有没有人知道这种linker的选择有些什么基本原则或者说像PCR引物设计
那样有些什么要点呢？ |
s*********y
发帖数: 387 | 5 are you sure 50 aa is a candidate linker for FRET.
If I remember correctly, it is too long and no FRET shall be detected
between GFP and RFP with this linker.
How you choose this linker sequence, If possible, will you paste your linker
sequence?
We will be able to help more specifically.
定位和
【在 m******h 的大作中提到】
: 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
: 功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
: 50Aa的柔性linker连接。
: 结果我杯具了：
: 1，蛋白表达量急剧下降。
: 2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
: 但是两个颜色的荧光还都能看见。
: 目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！
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