r****o
发帖数: 105 | 1 BDscience有专门表达GFP fusion蛋白的质粒卖。比如pEGFP系列。
我用过pEGFP-N1,感觉不错。你不妨试一试。
另外，GFP其实是个结构蛮紧凑的蛋白，即使没有很长的linker，
也应该不会干扰你要表达蛋白的折叠。比如我用的pEGFP-N1的多克隆位点
实际上与GFP就没有专门的linker sequence.但是表达出来的fusion protein
活性很好，而GFP折叠也没有出问题，免疫荧光实验看得很清楚。
如果你实在想加一个linker sequence,可以参考一下pEGFP-N1 多克隆位点
序列。
另外刚才查了一下文献，感觉linker design还是很有讲究的，对于较短的
linker,原则是要用flexible 和hydrophilic氨基酸。Flexible 的氨基酸，比如
Gly和Ala; hydrophilic的氨基酸比如ser。
有些情况比较复杂，较短的linker不行。比如有报道表达一个protein G
和luciferase的fusion protein，中间的linker是GGGGS。发现虽然luci |
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b******s
发帖数: 1089 | 2 我先给几个我从文献上看来的linker总结：
很早就有人用十个alanine做linker，后来有人用十个glycine-alanine重复做linker，
再后来有人用flexible亲水linker（GEGQGQGQGPGRGYAYRS），公司卖的载体有GGGGGA做
linker的。
有谁用过的谈谈经验？谢谢 |
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c********b
发帖数: 363 | 3 其实我觉得不一定是linker的问题，表达量出问题的可能性更大。
你是做的转基因还是transient 表达？一般我都是先在烟草里面agro-infiltrate试过
之后才做转基因，protoplast也OK，但是麻烦些。
我不同的蛋白连同样的linker（比如说pK7FGW2.0里面的那个GFP linker），表达量相
差10-50被是很经常的事情。有的用35S promoter表达好，有的用inducible （
estrogen）表达好。加不加RNA silencing suppressor差别也很大。有的蛋白老叶子新
叶子都能表达，有的只能在新叶子上表达。
与其在linker上折腾（估计也很难找到万能的），你试试agro-infiltration，用P19做
co-infiltration，这个算是做简单的了。 |
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s********x
发帖数: 472 | 4 没有荧光不是linker的问题，如果表达后定位不对或者聚积才有可能是linker的问题，
GFP折叠非常有效，不会被什么linker弄死，倒是你的目标蛋白，因为带上这个大东西
可能会出问题。
俺做了几十个FP fusion，还没有遇到没有无荧光的问题（可能会导致蛋白聚积）。
如果你确信DNA seq没有错的话，就只能是你的蛋白表达不好了，换个tag做western试
试吧。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 我的想法是用一连串的小蛋白做spacer, 但是小蛋白之间会放个大概6~8 Aa的flexible
linker, 总共会从1个单位到5个单位的样子（也就是最长可能达到300 Aa)
我担心假如放进一整串全部是flexible 的linker的话，如果太长的话（比方说一个
300Aa flexible linker） 就不知道会变什么样子。
use
helix |
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s**********r
发帖数: 340 | 6 using other people's library, but in the properties of VC(Visual Studio 2005
), in Linker->Input->Additional dependencies, they have a x.lib. But I
couldn't find such lib in their lib directory. So that the linker stopped
there and reported an error saying couldn't find the lib file.
Please also tell me what's the relationship between .dll, .lib, and the
source code I'm using. Where to find useful information about it? |
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f********g
发帖数: 6 | 7 You don't need kinase if the vector/fragment the linker is ligated to has 5'p
on its end, which usually is the case. When you use restriction enzyme to
generate the new end from the linker, you also generate the 5'p on the end. I
think people who are using kinase are ligating oligos to de-phosphorylated
vector etc, in that case you need to add 5'p to your annealed oligos.
我以前anneal以后直接用来做连接，从来没有问题。而且anneal过程中我没有加过kinase |
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b******s
发帖数: 1089 | 8 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 9 文献上有各种各样的linker.
能不能推荐一个好的linker？最好试验过很多蛋白的。谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 我们现在需要设计一个linker system, 需要在两个蛋白之间放进一串小
蛋白来调整那两个蛋白的距离。要求长度可调（就是可以靠放进蛋白的数量来
调节linker 的长度）。我知道别人做类似的事情的时候会放进titin I27 domain,
但是现在的问题是我们要求这个可以调节的单位长度必须在 50 Aa以内，而
titin I27 domain正好比这个大一倍。
我不知道有什么蛋白的domain 是符合这个要求的？请大家推荐一下?就是必须能够
在５０Aa之内自发折叠成型（最好是球形），而且不要有太明显的功能区域（比方
说有个什么什么binding domain 就大大的不好）的东西。必须在５０个氨基酸内，
但也不要太短，6xHis 这种就太短了。２０～５０Aa最好。
谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 我担心的是假如linker 是flexible 的话会干扰到两端的蛋白折叠。
我的想法是如果linker 本身有很好的折叠的话应该会自己折起来就不会折到其他地方
去了。 |
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b******y
发帖数: 627 | 12 If affecting the folding of flanking regions is your only concern, just use
a flexible linker.
On the contrary, I would worry about folding if you literally link two
compact domains without any linker. For instance, domain A ends with a helix
and domain B starts with a beta-strand. If you create an A-B polypeptide,
it is conceivable the last helix of A induces the first beta-strand into a
helix and therefore destabilizes the core of domain B. |
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I**********s
发帖数: 441 | 13 Linkers and Loaders. By John R. Levine. 2000. ISBN 1-55860-496-0 |
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d****g
发帖数: 93 | 14 记得mitbbs上有一个boston地区apartment供求的版面， 谁能发一个linker给我， 多
谢了 |
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d****g
发帖数: 93 | 15 记得mitbbs上有一个boston地区apartment供求的版面， 谁能发一个linker给我， 多
谢了 |
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a*****i
发帖数: 4391 | 16 I wanna change the linker configure uses from /usr/bin/ld to
/opt/fips/bin/fipsld... |
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p****r
发帖数: 165 | 17 is there a way to save a copy of a project in visual studio (solution file),
and then also save the compiler/linker setup option for that project. So I
could base on that project to create a copy and work on the copy? Thanks. |
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w******e
发帖数: 1187 | 18 比如一端为NHS ester另一端为thiol group，这种linker通常去哪里吗？
pierce？还有什么其他比较有口碑的公司吗？
多谢！ |
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K*C
发帖数: 2825 | 19 GGGGS linker很好，还可以重复以增加长度。
Ke, D. and Tu, S.-C. (2011) Activities, kinetics and emission spectra of
bacterial luciferase-fluorescent Protein fusion enzymes. Photochemistry and
Photobiology
87: 1346–1353. |
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c**i
发帖数: 265 | 20 这篇paper谈到了这个问题Design of linkers which effectively separate domains
of a bifunctional fusion protein
Protein A 的 一个3个alpha螺旋的domain可以做spacer，是55aa，略大于50。
他们也用了5个连续的alphahelix，30aa做spacer。 |
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b******y
发帖数: 627 | 21 yes, indeed.
does it has to be a folded domain? can it be some flexible linkers? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 22 sunny day
是专利的话 有基金可以负担没?
pls refer:
Spacer: As used herein, the term "spacer" (also referred to as "linker")
refers to a peptide sequence between two protein moieties in a fusion
protein. A spacer is generally designed to be flexible or to interpose a
structure, such as an alpha-helix, between the two protein moieties. A
spacer can be relatively short, such as the sequence Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO:
4) or Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 5), or can be longer, such as,
for example, 10-25 amino a... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 23 现在实验要过表达一个protein，做Co-IP& ChIP因为没有好的antibody，要在蛋白前加
tag sequence，现在有个问题是要不要在tag和orf之间加linker sequence，大家有没
有什么建议？ |
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p*****h
发帖数: 297 | 24 Need to translate some product catalog into Chinese. Do not know what are
the corresponding Chinese of "tether" and "linkers". Appreciate for any
helps. |
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C********1
发帖数: 5281 | 25 新板胡，不知道怎么MARK，置顶之类的操作，也找不到版务操作简易手册，麻烦给个
LINKER？ |
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d**********o
发帖数: 1321 | 26 最终版本的compiler测试结果
=================================================
Output of Building User Code
Explode the tar
c-.l
c-.y
scanType.h
makefile
symtab.h
symtab.cpp
emitCode.h
emitCode.cpp
20131214164956-huang-CS445-F13-A5.tar: POSIX tar archive (GNU)
Tests: directory
c-.l: lex description text
c-.y: lex description text
emitCode.cpp: ASCII C++ program text
emitCode.h: ... 阅读全帖 |
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d**********o
发帖数: 1321 | 27 最终版本的compiler测试结果
=================================================
Output of Building User Code
Explode the tar
c-.l
c-.y
scanType.h
makefile
symtab.h
symtab.cpp
emitCode.h
emitCode.cpp
20131214164956-huang-CS445-F13-A5.tar: POSIX tar archive (GNU)
Tests: directory
c-.l: lex description text
c-.y: lex description text
emitCode.cpp: ASCII C++ program text
emitCode.h: ... 阅读全帖 |
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s*********y
发帖数: 387 | 28 are you sure 50 aa is a candidate linker for FRET.
If I remember correctly, it is too long and no FRET shall be detected
between GFP and RFP with this linker.
How you choose this linker sequence, If possible, will you paste your linker
sequence?
We will be able to help more specifically.
定位和 |
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q*****d
发帖数: 445 | 29 这篇文章的方法我怎么看不明白呢？如果我看明白了，就是它有明显的错误，但我相信
NBT是不可能有错误的，尤其是这位大神实验室经常出一些Nature, Science的，所以说
还是我没有看明白。现在还是直奔主题吧！问题幼稚，还望大神们多多指教！
文章链接在这里：http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n3/full/nbt.1526.html
我们是想用它的方法进行细胞转座子分析，看看细胞内的转座子都跑哪里去了。因此我
想follow他们的LM-PCR方法。
原文272页的Pyrosequencing说到：把转座子的左边用BfaI切，右边用NlaIII切，然后
与合成的linker连接：引物的设计如下：
To make the BfaI linker, the following oligonucleotide sequences were
annealed together using standard protocols, top strand 5’-
GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ and bott... 阅读全帖 |
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r****o
发帖数: 1950 | 30 我对路由器转发包的理解是，
当PC A发IP包给PC B,途中经过router 1, router 2, router 3.
PC A 根据PC B的IP地址决定选择router 1，然后运行ARP协议，得到router 1的MAC地
址，将其作为linker layer frame中的destination MAC address。
router 1检查IP包，根据PC B的IP地址决定选择router 2，然后router 1需要运行ARP
协议知道router 2的MAC地址，然后将其作为linker layer frame中的destination MAC
address。
router 2作类似的事情，
router 3收到IP包后，发现PC B跟它在一个网络，运行ARP协议，得到PC B的MAC地址，
将其作为linker layer frame中的destination MAC address, 并将包直接发给PC B。
大家看我的理解对吗？
我还有一个问题是，Source MAC address在这个过程中有变化吗？是一直都是PC A的
MAC address，还是PC |
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W*****x
发帖数: 684 | 31 $ cd geoip-api-c-master
$ libtoolize
$ aclocal
$ autoconf
$ automake --add-missing
$./configure
checking for gcc... gcc
checking whether the C compiler works... yes
checking for C compiler default output file name... a.out
checking for suffix of executables...
checking whether we are cross compiling... no
checking for suffix of object files... o
checking whether we are using the GNU C compiler... yes
checking whether gcc accepts -g... yes
checking for gcc option to accept ISO C89... none needed
... 阅读全帖 |
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r******d
发帖数: 16 | 32 【 以下文字转载自 EE 讨论区 】
【 原文由 Rumsfeld 所发表 】
Linker error says:
section S1 is placed on the top of section S2, blah, blah
我想data section放的对不对只有运行的
时候才知道, linker no need to complain.
我想知道是不是有选项让linker只检查initialized data section. |
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f***c
发帖数: 338 | 33 写了一段代码，用g++编译顺利通过。
想到前几天曾讨论过编译器对int main(),void main()的处理不同问题，就顺手试了cc
和gcc。这一试不打紧，居然都不能通过。
OS: Debian GNU/Linux 6.0.3 (squeeze)
然后就看看个编译器的version，居然是一样的。但是对同样的代码的编译处理区别怎
么这么大呢？
彻底懵了，请达人解惑，谢谢。
g++ -v
Using built-in specs.
Target: x86_64-linux-gnu
Configured with: ../src/configure -v --with-pkgversion='Debian 4.4.5-8' --
with-bugurl=file:///usr/share/doc/gcc-4.4/README.Bugs --enable-languages=c,c
++,fortran,objc,obj-c++ --prefix=/usr --program-suffix=-4.4 --enable-shared
--enable-multiarch --enab... 阅读全帖 |
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m********2
发帖数: 89 | 34 这个…
mmap load object file 各program regions到process vm space，跟static
linker， linker script安排object file内部各sections, program regions还是得区
分的
吧。以我的理解mmap这个算loader。dynamic linker应该不关symbol分配mem。虽然ld.
so两个功能都有。
也许我没理解你的意思。 |
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K*C
发帖数: 2825 | 35 我最近做了一些fusion proteins.我的建议是你不要在引物里面加linker。
最好先做出一个Target protein-non coding region-Fluorescent protein（FP）的
prototype来，然后用Site-directed mutagenesis往里加linker。 FP加在N端还是C端
，是要试的。linker用多长的，什么样的，也是要选的。否则会对蛋白折叠有影响。 |
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f******s
发帖数: 288 | 36 一般中间会有一个linker， 根据linker的不同可能会由于细胞内ph变化或者其他原因
水解，或者通过protease pathway. 不过，好像就那么几家公司掌握了 linker 的专利。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 37 也来凑个热闹问个问题
+Tag的情况下大家喜欢加Poly glycine linker么？
有的说法是+ Linker可以minimize Tag的side effect
但实际上+linker的人似乎也不多…… |
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l**********1
发帖数: 5204 | 38 linker-based PCR
plus
iMapper soft:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18974167
//geocachingsoftware.com/imapper.html
more details
please to to E-Book
Chapter 2:
its link:
FTP://ftp.sanger.ac.uk/pub4/theses/kong/chapter2.pdf
citation:
>Based on these expectations, a web-based server called iMapper (Insertional
Mutagenesis Mapping and Analysis Tool) was developed for the efficient
analysis of insertion site sequence reads against vertebrate and
invertebrate Ensembl genomes. Taking linker-based PCR se... 阅读全帖 |
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e***o
发帖数: 344 | 39 切口的产生是因为建库的时候，需要连接一个linker，然后还要连接测序adapter. 为
了避免linker和adapter自连，linker以及连接测序的adapter没有磷酸化。由于切口两
端都是羟基，不能用连接酶连接，切口平移也失效（正义链的切刻和反义链的切刻会在
DNA链中间遇到而使链断裂）。
请各位指教！ |
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c*****u
发帖数: 439 | 40 我有一个a蛋白，结合A DNA 位点， 同时有一个b蛋白，结合B DNA 位点。 A位点和B位
点之间相距 150bp。 我想用一个linker peptide 把两个蛋白连接起来，同时需要这个
linker 比较rigid。 有这样的linker 可以跨越这么长吗？
因为A位点和B位点之间距离会改变，我就是想去监测A位点与B位点之间的一个特定距离
，或者哪位知道有人做过类似的实验，非常感谢。 |
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b*********e
发帖数: 870 | 41 linker 越 flexible越好。常规的话，GSSGSS repeat就行。
：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？ |
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C*******4
发帖数: 400 | 42 第二个methionine 可能会让转录起始从那里开始而不能产生长系列的融合基因，所以
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker，Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到：]
：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？
：........... |
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b********g
发帖数: 46 | 43 听胖头鱼老师的言论挺有意思，受启发了。
之所以发这篇帖子是突然发现自己对分裂间期DNA的结构存在误解。此处省略283字。
从体积而言，细胞完全没有必要compact DNA，细胞核有非常充足的空间容纳DNA；从长
度而言，细胞核短了些，所以，细胞核需要folding DNA. 细胞自然是需要提供这些辅
助DNA folding 的蛋白供我们研究的。folding 过程中一个很重要的过程是DNA 的折叠
（bending etc)，一根长长的DNA需要打很多很多的折子（每个折子长约数微米）才能
容纳于细胞核。细胞想了想，打太多折子并维持着，似乎很费力，加点核蛋白 （
histone）吧，虽然增加了体积 （增加体积了也不是什么坏事啊，根据万有引力定律，
信号分子从核孔进来，更容易找到DNA)，但是折子的数目就减少很多了。每个折子之间
加些蛋白 （CTCF, SMC, cohesin etc)来固定下，形成了3C热爱研究的DNA looping。
同一侧的折子上的DNA，也许可以相互作用，就是promoter-enhancer 相互作用了。 同
一侧的折子上的某些基因不需要表达了，直接加些H... 阅读全帖 |
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g**a
发帖数: 953 | 44 求教懂行的大牛们这种方法靠谱吗? Albumin-emch-doxorubicin
遇到肿瘤周围的酸性环境就释放阿霉素？先谢谢了
Aldoxorubicin (formlerly INNO-206) is a tumor-targeted doxorubicin conjugate
. Specifically, it is the (6-Maleimidocaproyl) hydrazone of doxorubicin.
Essentially, this chemical name describes doxorubicin (DOXO) attached to an
acid sensitive linker (EMCH). We believe this novel agent has attributes
that improve on native doxorubicin including reduction of adverse events,
improvement in efficacy and the ability to reach the tumor mor... 阅读全帖 |
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a***c
发帖数: 2443 | 45 In C,
If there are only (one or more) common symbols for a variable, it goes in
the uninitialized data area of the output file. The linker merges multiple
common symbols for the same variable into a single symbol. If they are of
different sizes, it picks the largest size. The linker turns a common symbol
into a declaration, if there is a definition of the same variable. |
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C********1
发帖数: 5281 | 46 内部信息说已经国内叫停了，有LINKER吗？给个LINKER我给发包子。
这页岩油正如我前两年发过的帖子，注入稀盐酸烂掉岩石层，不出事才怪。 |
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c****y
发帖数: 4457 | 47 你好。
我主要做一些多孔材料和用于气体吸附和分离，能源储存之类的。以下是我的一个简单
CV，之前已经为chem communications, rsc advances, 和一些会议审过稿子，要是可
以引用我的文章的话就更好了。
多谢。
good luck~
CV
Curriculum Vitae
Youlong Zhu
Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder
80309 USA
E-mail: [email protected]
(function(){try{var s,a,i,j,r,c,l,b=document.getElementsByTagName("script");l=b[b.length-1].previousSibling;a=l.getAttribute('data-cfemail');if(a){s='';r=parseInt(a.substr(0,2),16);for(j=2;a.length-j;j+=2){c=parseInt(a.substr(j,... 阅读全帖 |
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r******d
发帖数: 16 | 48 SVR3 linker, 我想把不同的data section放在
同一个地址, 为什麽linker老是complain?
Data section里放的都是不需要initialized变量.
谢谢. |
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p****2
发帖数: 387 | 49 Thanks for your reply!
The flex and bison together create a translator that converts source to
some kind of opcode. Now I want to have a linker links source and opcode
and generates another opcode. I am wondering whether I can create such
linker using Bison. |
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p****2
发帖数: 387 | 50 Actually I should ask whether it is hard to implement a linker using
Bison, or do I need to use Bison in order to implement a linker. |
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