b**********8
发帖数: 349 | 1 新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
现在我有两个问题,
1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
的中断？
2）在网上翻了些帖子，发现有的人会在挑出单个colony培养贴壁后在做有限稀释，挑
取单克隆，这样做是不是会是拿到真阳性克隆的机会更大？可不可以按照这样的思路来
做，先用我上面的挑取，培养并鉴定出一批（视运气好坏多少不等）有阳性反应的
colony（姑且认定这个colony里面含有我想要的稳定转染的细胞），再把这些colony的
细胞分别做有限稀释，最后分别鉴定每个单克隆，最终获得最优化的稳定转染细胞。
请高手指点，任何意见和建议都会给我很大帮助，先谢谢大家。 |
c**n
发帖数: 73 | 2 我是用serial dilution做的稳定细胞转染
得到阳性细胞后曾经试过把G418的浓度降低一半
阳性虽然还在，但是表达量降低将近一半
查过网上论坛，发现这个是epigenetical modification
于是重新用高浓度的G418，再次得到高表达的阳性细胞。
所以取决于你转染的质粒对细胞的毒性，药物有可能会很重要，即使在你得到阳性细胞
后。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
: 时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
: ，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
: colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
: 取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
: 挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
: 现在我有两个问题,
: 1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
: 出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
: 的中断？
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a******7
发帖数: 7936 | 3 做过牛intramuscular adipocytes的immortalization，转染带抗G418的端粒酶，怕转
染效果不好连续转染两次，存活的细胞都抗G418，并且一段时间不加G418也不会改变抗
性。 |
b**********8
发帖数: 349 | 4
多谢回复，能否提供您关于serial dilution的更详细的信息，比如什么时候dilution
，转染后第二天？还是如我帖子中描述的挑到阳性colony后再dilution？
另外，重新用高浓度的G418后再次得到高表达的阳性细胞，请问这个细胞和之前浓度降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？
【在 c**n 的大作中提到】
: 我是用serial dilution做的稳定细胞转染
: 得到阳性细胞后曾经试过把G418的浓度降低一半
: 阳性虽然还在，但是表达量降低将近一半
: 查过网上论坛，发现这个是epigenetical modification
: 于是重新用高浓度的G418，再次得到高表达的阳性细胞。
: 所以取决于你转染的质粒对细胞的毒性，药物有可能会很重要，即使在你得到阳性细胞
: 后。
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c**n
发帖数: 73 | 5 很久之前所以既不清楚了
但肯定是转染后过了好几天
用的是polyclonal的细胞作dilution
在dilution之前并没有经过挑阳性细胞这步
我用的是corning 的single cell cloning protocol
你google就能找到
是同一批细胞.
dilution
降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 多谢回复，能否提供您关于serial dilution的更详细的信息，比如什么时候dilution
: ，转染后第二天？还是如我帖子中描述的挑到阳性colony后再dilution？
: 另外，重新用高浓度的G418后再次得到高表达的阳性细胞，请问这个细胞和之前浓度降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？
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b**********8
发帖数: 349 | 6
非常感谢
【在 c**n 的大作中提到】
: 很久之前所以既不清楚了
: 但肯定是转染后过了好几天
: 用的是polyclonal的细胞作dilution
: 在dilution之前并没有经过挑阳性细胞这步
: 我用的是corning 的single cell cloning protocol
: 你google就能找到
: 是同一批细胞.
:
: dilution
: 降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？
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D**A
发帖数: 311 | 7 the genome-inserted plasmid DNA may affected by the chromosome around...
this may silence your gene.
Use modified BAC if you want to have a really stable expression |
D**A
发帖数: 311 | 8 BTW, the selection drug has to be always added into your culture medium... |
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b**********8
发帖数: 349 | 9
Many thanks.
Could you pls give more detailed information about BAC and stable
transfection? Or any literature would help me greatly.
【在 D**A 的大作中提到】
: the genome-inserted plasmid DNA may affected by the chromosome around...
: this may silence your gene.
: Use modified BAC if you want to have a really stable expression
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s*****g
发帖数: 7857 | 10 转染,挑单克隆 是对的.
但只要培养就要加抗生素时刻筛选.(除了做实验时候,撤抗生素.)--"一定不能中断选择药物" |
D**A
发帖数: 311 | 11 search Tony Hyman in MPI-Dresden
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: Many thanks.
: Could you pls give more detailed information about BAC and stable
: transfection? Or any literature would help me greatly.
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c****t
发帖数: 76 | 12 这种epigenetical modification和转染的质粒有关吗?
我最近做的稳定表达的细胞也是培养一段时间(3~4周)后表达降低(没有加G418),但是我
以前建立的没有这种情况.
【在 c**n 的大作中提到】
: 我是用serial dilution做的稳定细胞转染
: 得到阳性细胞后曾经试过把G418的浓度降低一半
: 阳性虽然还在，但是表达量降低将近一半
: 查过网上论坛，发现这个是epigenetical modification
: 于是重新用高浓度的G418，再次得到高表达的阳性细胞。
: 所以取决于你转染的质粒对细胞的毒性，药物有可能会很重要，即使在你得到阳性细胞
: 后。
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c******r
发帖数: 3778 | 13 这玩意儿就是一个体力活儿。都是实验室常规。
做起来也简单。就是ls说的。你先不要挑clone。直接pool用药到足够cell，然后seed
到96孔板上。数好细胞数，大概是每个板放50个细胞，就是每个孔0.5个细胞的样子。
seed几个板，4-5个其实就够了。这样大概一共seed了200到250个细胞。还是要在药里
面长，也可以浓度减半。如果够狠，多seed几个板，正常浓度的药也能长起来的。然后
就是说confirm一下表达，挑表达量合适的留下几个clones就可以了
【在 b**********8 的大作中提到】
: 新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
: 时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
: ，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
: colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
: 取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
: 挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
: 现在我有两个问题,
: 1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
: 出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
: 的中断？
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b**********8
发帖数: 349 | 14
seed
谢谢，你说的这个方法其实倒不错，请问有人这样做过吗？成功过吗？
【在 c******r 的大作中提到】
: 这玩意儿就是一个体力活儿。都是实验室常规。
: 做起来也简单。就是ls说的。你先不要挑clone。直接pool用药到足够cell，然后seed
: 到96孔板上。数好细胞数，大概是每个板放50个细胞，就是每个孔0.5个细胞的样子。
: seed几个板，4-5个其实就够了。这样大概一共seed了200到250个细胞。还是要在药里
: 面长，也可以浓度减半。如果够狠，多seed几个板，正常浓度的药也能长起来的。然后
: 就是说confirm一下表达，挑表达量合适的留下几个clones就可以了
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