m**h
发帖数: 381 | 1 需要一些BAC DNA标记做FISH。
maxi prep了好几次，
用了nucleobind和qiagen－large construct kit,
结果都不理想，yield非常非常底，
请教版上大侠们，
有什么好的kit可以推荐吗？
大提BAC yield底，有什么需要注意的吗？
谢谢 ！！ |
d***s
发帖数: 1062 | 2 我用qiagen的kit提，yield也很低，用了600ml的菌液，大概只能提到200ug左右，最后离心完
基本看不到沉淀。 |
m**h
发帖数: 381 | 3 哎呀，你这yield已经很不错了！我今天忙活了一天，500ml菌液，只提到了50ug不到，
关键是融解的时候TE还加多了，结果浓度底的不好意思见人。
我的也是最后一步离心完后啥也看不到，对着光仔细看看，隐约感觉有些小点点，估计
就是DNA吧。
咳，急人啊！
后离心完
【在 d***s 的大作中提到】
: 我用qiagen的kit提，yield也很低，用了600ml的菌液，大概只能提到200ug左右，最后离心完
: 基本看不到沉淀。
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s******s
发帖数: 13035 | 4 Elution buffer 加热到55C，异丙醇沉淀4C过夜。
【在 m**h 的大作中提到】
: 需要一些BAC DNA标记做FISH。
: maxi prep了好几次，
: 用了nucleobind和qiagen－large construct kit,
: 结果都不理想，yield非常非常底，
: 请教版上大侠们，
: 有什么好的kit可以推荐吗？
: 大提BAC yield底，有什么需要注意的吗？
: 谢谢 ！！
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d***s
发帖数: 1062 | 5 最后我就加200ul buffer在事先画好的区域里，50度水浴横着放10分钟。我都懒得找沉
淀了。 |
m**h
发帖数: 381 | 6 谢谢shakuras！
不知道你用的是不是也是qiagen的kit？还是别的kit？
我的elution buffer是按照手册上说的加热到65度的。有两步异丙醇沉淀，我猜你说的
应该是最后一步4oc过夜吧？下次试试看！
【在 s******s 的大作中提到】
: Elution buffer 加热到55C，异丙醇沉淀4C过夜。
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m**h
发帖数: 381 | 7 很不幸的，我也加了200ul buffer。。。可怜我还55oc放了1个小时。。。咳。
：（
【在 d***s 的大作中提到】
: 最后我就加200ul buffer在事先画好的区域里，50度水浴横着放10分钟。我都懒得找沉
: 淀了。
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d***s
发帖数: 1062 | 8 我第一步异丙醇省略了，说明书上说这一步主要是缩小体积用的，我就直接过柱子，过
得那叫一个慢啊。我会把lysis离两次心去蛋白，要不然柱子就堵住了。
【在 m**h 的大作中提到】
: 很不幸的，我也加了200ul buffer。。。可怜我还55oc放了1个小时。。。咳。
: ：（
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m******e
发帖数: 18 | 9 我用的CLONTECH的NucleoBond Maxi Kit 提的BAC 和 YAC DNA 做FISH 探针。产量是很
低，BAC得到大约100ug，YAC是从yeast里提的，大约50ug. BAC通常几百个Kb,低拷贝，
说明书上建议1200ml culture.1ug DNA 可以标记2个玻片，50ug够用几次了。 |
s******s
发帖数: 13035 | 10 Origene的Maxiprep kit
我倒是没做过BAC，正打算做，今天下午刚向实验室一美国帅哥请教，他
大概抽过几十个BAC了。说一般200ml能拿到1mg。
【在 m**h 的大作中提到】
: 谢谢shakuras！
: 不知道你用的是不是也是qiagen的kit？还是别的kit？
: 我的elution buffer是按照手册上说的加热到65度的。有两步异丙醇沉淀，我猜你说的
: 应该是最后一步4oc过夜吧？下次试试看！
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m**h
发帖数: 381 | 11 哦，这样啊，那除了省略的这一步，你其它的步骤都是按说明书上的做吗？
谢谢！
【在 d***s 的大作中提到】
: 我第一步异丙醇省略了，说明书上说这一步主要是缩小体积用的，我就直接过柱子，过
: 得那叫一个慢啊。我会把lysis离两次心去蛋白，要不然柱子就堵住了。
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m**h
发帖数: 381 | 12 200ml拿到1mg啊！
拜托shakuras能不能再请教一下你实验室的那个美国帅哥，说BAC yield很低，还有什
么其它需要注意的地方吗？
谢谢！
【在 s******s 的大作中提到】
: Origene的Maxiprep kit
: 我倒是没做过BAC，正打算做，今天下午刚向实验室一美国帅哥请教，他
: 大概抽过几十个BAC了。说一般200ml能拿到1mg。
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f**u
发帖数: 346 | 13 这个产率有点太夸张了吧，我觉得不太可能达得到。
我猜要不就是genomic的污染比较多，要不就是这个BAC是可以诱导成多拷贝的。
普通得BAC的话500ml细菌拿到100ug左右应该是比较正常的产率，
这么多DNA最后的pellet应该看得很清楚才对。
【在 s******s 的大作中提到】
: Origene的Maxiprep kit
: 我倒是没做过BAC，正打算做，今天下午刚向实验室一美国帅哥请教，他
: 大概抽过几十个BAC了。说一般200ml能拿到1mg。
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s******s
发帖数: 13035 | 14 下个礼拜我自己抽的时候再多问问
【在 m**h 的大作中提到】
: 200ml拿到1mg啊！
: 拜托shakuras能不能再请教一下你实验室的那个美国帅哥，说BAC yield很低，还有什
: 么其它需要注意的地方吗？
: 谢谢！
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b*********b
发帖数: 64 | 15 I use QIAGEN Plasmid Midi kit. 100ml culture could give about 30-50ug. I
tried Qiagen's large construct kit.But in my hand, the midi kit is much much
better than the large construct kit, and also takes much less time.The
following is the protocol I got from Qiagen.
User-Developed Protocol:
Isolation of BAC DNA using the QIAGEN® Plasmid Midi Kit
This procedure has been adapted by customers from the QIAGEN® Plasmid
Midi Kit Protocol.It has not been thoroughly tested and optimized by QIAGEN.
This procedure has been used successfully for isolation of 150–250 kb BAC
DNA from a mouse-BAC library cloned in pBeloBAC11 from Escherichia coli
strain HB101/r. The yield of BAC DNA from 100 ml culture was typically 20–
40 μg.
Please be sure to read the QIAGEN Plasmid Purification Handbook and the
detailed QIAGEN Plasmid Midi Kit Protocol carefully before beginning this
procedure.
Procedure
1. Pick a single BAC colony and inoculate a starter culture of 5 ml LB
medium containing the appropriate antibiotic.
2. Inoculate 0.5 ml pre-culture into 100 ml selective LB medium. Grow at 37
°C for 14 hours with vigorous shaking (~250 rpm).
3. Divide the cells into two 50 ml tubes, and harvest the cells by
centrifugation at 4500 x g for 20 min.
4. Resuspend each bacterial pellet in 10 ml Buffer P1.
Ensure that RNase A (100 μg/ml) has been added to Buffer P1.
5. Add 10 ml Buffer P2 to each tube. Mix thoroughly and gently by inverting
4–6 times,and incubate at room temperature for 5 min.
Check Buffer P2 before use for SDS precipitation due to low storage
temperatures. If necessary, dissolve the SDS by warming to 37°C.
6. Add 10 ml chilled Buffer P3 to each tube. Immediately mix by gently
inverting 4–6 times, and incubate on ice for 15 min.
7. Centrifuge at ≥20,000 x g for 30 min at 4°C. Remove supernatant
containing plasmid DNA promptly.
8. Centrifuge the supernatant again at ≥20,000 x g for 15 min at 4°C.
Remove supernatant containing plasmid DNA promptly.
9. Equilibrate a QIAGEN-tip 100 by applying 4 ml Buffer QBT, and allow the
column to empty by gravity flow.
10. Pool the two supernatants from step 8. Apply the sample to the QIAGEN-
tip and allow it to enter the resin by gravity flow.
11. Wash the QIAGEN-tip with 2 x 10 ml Buffer QC.
12. Elute DNA with 5 x 1 ml Buffer QF, prewarmed to 65°C.
Prewarming the elution buffer may help to increase yields. Eluting in 5
aliquots of 1 ml instead of 1 aliquot of 5 ml prevents cooling of the
elution buffer.
13. Precipitate DNA by adding 3.5 ml room-temperature isopropanol to the
eluted DNA.
Mix and centrifuge immediately at ≥15,000 x g for 30 min at 4°C. Carefully
decant the supernatant.
14. Wash the DNA pellet with 2 ml of room-temperature 70% ethanol and
centrifuge at ≥15,000 x g for 10 min. Carefully decant the supernatant
without disturbing the pellet.
15. Air-dry the pellet for 5–10 min, and redissolve the DNA in a suitable
volume of buffer (e.g., TE, pH 8.0, or 10 mM Tris·Cl, pH 8.5). |
y****m
发帖数: 37 | 16 CsCl density gradient
【在 m**h 的大作中提到】
: 需要一些BAC DNA标记做FISH。
: maxi prep了好几次，
: 用了nucleobind和qiagen－large construct kit,
: 结果都不理想，yield非常非常底，
: 请教版上大侠们，
: 有什么好的kit可以推荐吗？
: 大提BAC yield底，有什么需要注意的吗？
: 谢谢 ！！
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m**h
发帖数: 381 | |
s******s
发帖数: 13035 | 18 今天确认过了，是100ug不是1mg，数量级有问题，让大家受惊了
【在 m**h 的大作中提到】
: 200ml拿到1mg啊！
: 拜托shakuras能不能再请教一下你实验室的那个美国帅哥，说BAC yield很低，还有什
: 么其它需要注意的地方吗？
: 谢谢！
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