t********7
发帖数: 22 | 1 各位大侠，
我需要从一个bacteria的chromosome里克隆一段60kb的dna,并放到E.Coli里去表达。请
问有什么好的PCR方法能够克隆60kb的dna的。我目前只看到Roche好像有卖克隆5－20kb
的kit. 不知道有没有直接可以一次pcr 60kb的方法。（如果不行，是不是需要多次克
隆片段，然后ligation？）
还有，如果要放到e.coli表达，一般是用BAC做vector么？大家有相关什么文章可以推
荐阅读的嘛？或者BAC有哪里可以买的么？
先谢谢了。 |
b******n
发帖数: 4225 | 2 看看能不能找公司做吧
自己做起来估计有点麻烦，如果你不熟悉BAC的操作的话
20kb
【在 t********7 的大作中提到】
: 各位大侠，
: 我需要从一个bacteria的chromosome里克隆一段60kb的dna,并放到E.Coli里去表达。请
: 问有什么好的PCR方法能够克隆60kb的dna的。我目前只看到Roche好像有卖克隆5－20kb
: 的kit. 不知道有没有直接可以一次pcr 60kb的方法。（如果不行，是不是需要多次克
: 隆片段，然后ligation？）
: 还有，如果要放到e.coli表达，一般是用BAC做vector么？大家有相关什么文章可以推
: 荐阅读的嘛？或者BAC有哪里可以买的么？
: 先谢谢了。
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h***e
发帖数: 146 | 3 建库 然后用red/ET recombineering 来stitch ？ |
t********7
发帖数: 22 | 4 Thanks a lot! 你知道有什么公司来做这个的嘛？不知道价格多少？
【在 b******n 的大作中提到】
: 看看能不能找公司做吧
: 自己做起来估计有点麻烦，如果你不熟悉BAC的操作的话
:
: 20kb
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h**********r
发帖数: 671 | 5 Rebuilding microbial genomes, BioEssays 29:580–590, 2007 Wiley
Periodicals. |
e***o
发帖数: 344 | 6 Pred/ET recombineering ,
easy ! |
t********7
发帖数: 22 | 7 谢谢！ 我想克隆的60kb gene islands 在某一bacteria的genome里，请问能推荐什么好的PCR方法可以一次把它整片段都PCR出来，
是不是只有这样有了linear insert之后，才能用pRed/ET recombineering把60kb插入到BAC plasmid里, 最后transform到另一个strain里？
不好意思，问题可能比较弱....不过真的不知道有什么好办法
【在 e***o 的大作中提到】
: Pred/ET recombineering ,
: easy !
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h***e
发帖数: 146 | 8 60KB作为insert 在 Red/ET recombineering 也实在太大啦啊
PCR还要测序 不保险 还是建库吧 然后用Red/ET 来 缝合 |
t********7
发帖数: 22 | 9 不知道各位能不能建议一些建库和Red/ET相关的文章，这样我可以知道具体怎么操作和
可行性？
另外gateway需要需要有特定的att次序对来recombination，不知道Red/ET的也是一样
？还是可以任意的次序，只要是相同就可以？
非常谢谢！ |
h***e
发帖数: 146 | 10 Volume 12, Issue 3, March 2005, Pages 349-356 Chemistry&Biology
Heterologous Expression of a Myxobacterial Natural Products Assembly Line in
Pseudomonads via Red/ET Recombineering
Silke C. Wenzel1, 2, Frank Gross1, 2, Youming Zhang3, Jun Fu3, A. Francis
Stewart4 and Rolf Müller1, 2,
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VRP-4FSV963-G&_user=1592387&_coverDate=03%2F31%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1525352222&_rerunOrigin=google&_acct=C000053620&_version
你不会也是做gene cluster的把 要不克隆这么大的基因？ |
t********7
发帖数: 22 | 11 太感谢你了。 不瞒您说，我确实正要做gene cluster reengineering ...
你肯定做了有很多经验了吧？
in
【在 h***e 的大作中提到】
: Volume 12, Issue 3, March 2005, Pages 349-356 Chemistry&Biology
: Heterologous Expression of a Myxobacterial Natural Products Assembly Line in
: Pseudomonads via Red/ET Recombineering
: Silke C. Wenzel1, 2, Frank Gross1, 2, Youming Zhang3, Jun Fu3, A. Francis
: Stewart4 and Rolf Müller1, 2,
: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VRP-4FSV963-G&_user=1592387&_coverDate=03%2F31%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1525352222&_rerunOrigin=google&_acct=C000053620&_version
: 你不会也是做gene cluster的把 要不克隆这么大的基因？
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