t********7
发帖数: 22 | 1 各位大侠，
我需要从一个bacteria的chromosome里克隆一段60kb的dna,并放到E.Coli里去表达。请
问有什么好的PCR方法能够克隆60kb的dna的。我目前只看到Roche好像有卖克隆5－20kb
的kit. 不知道有没有直接可以一次pcr 60kb的方法。（如果不行，是不是需要多次克
隆片段，然后ligation？）
还有，如果要放到e.coli表达，一般是用BAC做vector么？大家有相关什么文章可以推
荐阅读的嘛？或者BAC有哪里可以买的么？
先谢谢了。 |
|
t********7
发帖数: 22 | 2 谢谢！ 我想克隆的60kb gene islands 在某一bacteria的genome里，请问能推荐什么好的PCR方法可以一次把它整片段都PCR出来，
是不是只有这样有了linear insert之后，才能用pRed/ET recombineering把60kb插入到BAC plasmid里, 最后transform到另一个strain里？
不好意思，问题可能比较弱....不过真的不知道有什么好办法 |
|
h***e
发帖数: 146 | 3 60KB作为insert 在 Red/ET recombineering 也实在太大啦啊
PCR还要测序 不保险 还是建库吧 然后用Red/ET 来 缝合 |
|
d***k
发帖数: 3225 | 4 我自己试了一下
http直接下的话也就50-60kb/s
用优蛋下的话波动在100-300之间 |
|
m*z
发帖数: 3102 | 5
哈哈谢谢~~我乱拍的, D300~这机器好啊~只是你压太厉害~~一般压到300KB一张 1024X
的图
你压到50-60KB所以不看不清楚了~
PLS：明天去派看看~哈哈~ |
|
l**n
发帖数: 2405 | 6 60kb=132.27736lbs
assume your weight was 132.27736, then your shit
weighted 0.47736lbs.
//puke |
|
v********l
发帖数: 736 | 7 我在上载。
不过我只能在学校上网，不很方便。
我现在上传的限速是60kB/s,不敢再大了。
！ |
|
l****i
发帖数: 698 | 8 是不是我的网络问题，我传文件上去，速度只有60KB/s,从同一个router上的电脑传也
是这个速度。我挂的是一个2.5的移动硬盘，瓶颈应该不是硬盘的原因吧。
大家的速度怎么样？ |
|
l***h
发帖数: 9308 | 9 QoS的话，买个可以刷番茄的路由器。我试过刷成dd-wrt，但QoS效果不好，因为界面设
置不能控制最大带宽。
通过番茄的QoS，保证能流畅观看pplive，基本上，通过把上行带宽控制在30Kbit/s(
4KB/s),下行带宽最大就能在1Mbit/s(130KB/。我试过把QoS关掉，下行带宽基本占满
3Mbit/s，上行也占满为500Kbit/s(60KB/s)。
但是，看CNTV，尽管对下行带宽要求不高（1M足以），但对上行带宽要求比较高，至少
要到80Kbit/s(10KB/s)。
因此，对于outbound设置在80Kbit/s(10KB/s)，对于p2p的应用，下载带宽基本上就控
制在1.5Mbit/s(190KB/s）以下。我是upto 3M的DSL，基本感受不到这些p2p对网络的影
响。 |
|
E*****P
发帖数: 591 | 10 不管是普通的下载，迅雷下载，还是 FlashGet，最高速度也就是五十几 KB/s。难道
AT&T Yahoo DSL 故意限制速度？
有没有办法可以提高速度？
谢谢！ |
|
e*i
发帖数: 10288 | 11 What's the package did you buy? |
|
E*****P
发帖数: 591 | 12 the package is "up to 1.5Mbps" |
|
e*i
发帖数: 10288 | 13 the maximum speed is about 150KB/s
try download windows xp sp2 or sp3 from microsoft. If you can't reach
that speed, then there is some problem. :P
AT&T usually gives you 80% of its claimed speed. (based on my experience.
I used its 1.5M, 3M, 6M DSL) |
|
E*****P
发帖数: 591 | 14 Thanks!
Shall I call ATT?
This "up to" crap is really annoying me. |
|
|
a****l
发帖数: 8211 | 16 1.5Mbps package最快的下载速度是 150kB/S.
但是，普通的下载的速度还取决于server的速度。BT的速度是不一定最快的。要测速度
，最好是用微软的网站，比如去www.microsoft.com/downloads下个几百兆上G的文件（
比如搞个vista servicapack），MS的server是非常快的，所以基本上你的网能多快就
能下载多快(象我这里就是基本上到package的理论最高速度了)。先去那里试一下，然
后再来告诉大家下载速度到底能有多快。 |
|
b******n
发帖数: 4225 | 17 看看能不能找公司做吧
自己做起来估计有点麻烦，如果你不熟悉BAC的操作的话
20kb |
|
h***e
发帖数: 146 | 18 建库 然后用red/ET recombineering 来stitch ？ |
|
t********7
发帖数: 22 | 19 Thanks a lot! 你知道有什么公司来做这个的嘛？不知道价格多少？ |
|
h**********r
发帖数: 671 | 20 Rebuilding microbial genomes, BioEssays 29:580–590, 2007 Wiley
Periodicals. |
|
e***o
发帖数: 344 | 21 Pred/ET recombineering ,
easy ! |
|
t********7
发帖数: 22 | 22 不知道各位能不能建议一些建库和Red/ET相关的文章，这样我可以知道具体怎么操作和
可行性？
另外gateway需要需要有特定的att次序对来recombination，不知道Red/ET的也是一样
？还是可以任意的次序，只要是相同就可以？
非常谢谢！ |
|
h***e
发帖数: 146 | 23 Volume 12, Issue 3, March 2005, Pages 349-356 Chemistry&Biology
Heterologous Expression of a Myxobacterial Natural Products Assembly Line in
Pseudomonads via Red/ET Recombineering
Silke C. Wenzel1, 2, Frank Gross1, 2, Youming Zhang3, Jun Fu3, A. Francis
Stewart4 and Rolf Müller1, 2,
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VRP-4FSV963-G&_user=1592387&_coverDate=03%2F31%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1525352222&_reru... 阅读全帖 |
|
t********7
发帖数: 22 | 24 太感谢你了。 不瞒您说，我确实正要做gene cluster reengineering ...
你肯定做了有很多经验了吧？
in |
|
x*******9
发帖数: 200 | 25 my photograph is smaller than 100kb, about 60Kb, How do guys make
photography is just 100kb, with 300x300 resolution? Thanks |
|
h****l
发帖数: 7290 | 26 【 以下文字转载自 BUAA 讨论区 】
【 原文由 leaflife 所发表 】
The following is some ideas, maybe it will work. It's owned
by a white person in US.
nope. i don't have enough bandwidth to support the site. heh
my upstream speed is limited to 15kBs.
using load balancing with my office line, i could get it to
60kBs tho.
tellt hem to ask unc.edu. or carnigie-mellon.
maybe for free.
if they approach them with the arguemnt that they are trying
to help support free speech in china, might be able to get
it hosted for free. |
|
