s********x
发帖数: 472 | 1 做分子的经验很少，限于简单clone和点突变。
最近需要把三个蛋白片段连起来，实在没有什么经验，请教板上的大牛一般这种
chimera protein怎么做。
有人建议我用一些多酶切位点的载体例如T vector或者bluescript之类，然后把三个片
段依次找好酶切位点连进去，但是我发现这三个片段可用的酶切位点很有限，而且要in
frame，很不好做；
还有策略是先酶切连接两个片段，可以用同尾酶使产物不再具有被切的危险，然后做
PCR扩增连接产物，然后再连接另外的片段，这个方案感觉快一些，但是不知道应该如
何具体做？酶切后连接后要不要纯化（用quick spin一类的column回收全部片段）？用
多少产物做下一步PCR？这种用连接产物做的PCR是否有需要特别注意的条件？
还有的策略就是用类似传统点突变的方法，先PCR出两个片段，中间有overlap，然后用
两头的primer把两个片段连接的片段P出来，不知道一般这种overlap的区域有多大？
PCR有何需要注意的？
不知道大家一般怎么做这种chimera，几种策略有何优缺点，恳请指教。万分感谢！ |
e****s
发帖数: 1125 | 2 overlapping pcr 应该最好。
overlapping区域不用很多，我一般把Tm 设成 40以上就足够了。
in
【在 s********x 的大作中提到】
: 做分子的经验很少，限于简单clone和点突变。
: 最近需要把三个蛋白片段连起来，实在没有什么经验，请教板上的大牛一般这种
: chimera protein怎么做。
: 有人建议我用一些多酶切位点的载体例如T vector或者bluescript之类，然后把三个片
: 段依次找好酶切位点连进去，但是我发现这三个片段可用的酶切位点很有限，而且要in
: frame，很不好做；
: 还有策略是先酶切连接两个片段，可以用同尾酶使产物不再具有被切的危险，然后做
: PCR扩增连接产物，然后再连接另外的片段，这个方案感觉快一些，但是不知道应该如
: 何具体做？酶切后连接后要不要纯化（用quick spin一类的column回收全部片段）？用
: 多少产物做下一步PCR？这种用连接产物做的PCR是否有需要特别注意的条件？
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s********n
发帖数: 2939 | 3 Overlap pcr和restriction enzymes digestion（可用酶切位点不在识别位点内的RE,
如BsaI）都可以，最简单就是直接合成基因。 |
g********4
发帖数: 4959 | 4 题目很误导人啊。我以为是问protein engineering问题的，其实问的是cloning问题。
实际上，chimera protein除了常见的GUS，GFP， LUC之外，其它蛋白fusion 表达成有
功能的还是蛮难的。 |
s********x
发帖数: 472 | 5 No need to mention it is not easy.
I did a lot of tag fusion before.
【在 g********4 的大作中提到】
: 题目很误导人啊。我以为是问protein engineering问题的，其实问的是cloning问题。
: 实际上，chimera protein除了常见的GUS，GFP， LUC之外，其它蛋白fusion 表达成有
: 功能的还是蛮难的。
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i***R
发帖数: 663 | |
d******1
发帖数: 709 | 7 In-Fusion® PCR Cloning System |
