m******i
发帖数: 1204 | 1 最近做了两次ELISA，结果都不好，快要崩溃了，blank wells全都有读数，不知道是哪
步出问题了？ |
w******e
发帖数: 1187 | 2 common mistake is leaking of reagent to adjacent wells. did you read the
whole plate? any signal in blank wells far away from any sample wells?
【在 m******i 的大作中提到】
: 最近做了两次ELISA，结果都不好，快要崩溃了，blank wells全都有读数，不知道是哪
: 步出问题了？
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f*********r
发帖数: 1233 | 3 才两次不好，用不着崩溃。
首先要明确，你用的kit是什么样的。白蛋白的ELISA kit有很多。有的是传统三明治，
有的是竞争式。如果你用的是竞争式，那么颜色最深的便是0点或者blank。
其次，（对于常规三明治elisa）blank点永远有读数，除非你用透光特别好的水晶盘。
如果它是0，那是因为你定义它为0。
然后，我不太清楚你说的不好指什么。如果说是标准曲线回归的不好，那么我建议你看
看我写的这篇介绍：
http://www.mitbbs.com/article/Biology/31389691_3.html
如果你能把情况说得更具体一点，最好能贴个图，那就更容易分析问题出在哪里。 |
m******i
发帖数: 1204 | 4 谢谢，看了一下数据，一个plate有两列blank，一列跟旁边的很接近，另一列是empty
well，但是数据也很接近。另外所有的blank值都很接近。所以不知道是不是washing
solution有问题。
【在 w******e 的大作中提到】
: common mistake is leaking of reagent to adjacent wells. did you read the
: whole plate? any signal in blank wells far away from any sample wells?
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m******i
发帖数: 1204 | 5 谢谢，受益匪浅。
数据不好是因为值不是随着浓度降低递减的，偶尔有的值升高
【在 f*********r 的大作中提到】
: 才两次不好，用不着崩溃。
: 首先要明确，你用的kit是什么样的。白蛋白的ELISA kit有很多。有的是传统三明治，
: 有的是竞争式。如果你用的是竞争式，那么颜色最深的便是0点或者blank。
: 其次，（对于常规三明治elisa）blank点永远有读数，除非你用透光特别好的水晶盘。
: 如果它是0，那是因为你定义它为0。
: 然后，我不太清楚你说的不好指什么。如果说是标准曲线回归的不好，那么我建议你看
: 看我写的这篇介绍：
: http://www.mitbbs.com/article/Biology/31389691_3.html
: 如果你能把情况说得更具体一点，最好能贴个图，那就更容易分析问题出在哪里。
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f*********r
发帖数: 1233 | 6 说说要做好一个elisa，应该注意哪些小地方。
1，先检查硬件。读盘的分光光度计，盘子等等要说得过去。至少光路当中没有脏东西
。这个肉眼看看就行。或者每个well里加等量的水、pbs或者kit提供的稀释溶剂等去读
一读。它们相差不大，而且都小于标准曲线中最小的一个点的值就可以。
elisa过程中，要冲洗几次。如果有多余的洗液残留在盘底，甚至干了以后有了印，可
能会有稍许影响。擦干净就好。
2，冲洗。说明书说洗几遍就几遍？别那么实诚。至少5遍。每次都用well能盛的最大量
（大约400微升）。每次洗，都把前一次残留的甩干净。用手甩就行。或者在桌上垫纸
巾，扣着使劲拍。放心，特异性结合了的抗原、抗体是洗不掉的。多洗只有好处没坏处
。反正kit里洗液这一瓶永远有富余。
如果忙，不能每次都洗彻底，没关系。最后一步冲洗（加显色剂之前的这次）洗狠一点
就可以（仅限于三明治elisa）。
3，混匀。试剂、样品、标准液等等，用之前一定混匀。有混浊的，争取把它溶化掉，
溶不掉的把它离心掉。费不了几分钟。
4，加样。这个已经在那个链接的文章里介绍过了。如果用排枪或者加样机，原则是一
样的。别忘了检查每个通 |
w******e
发帖数: 1187 | 7 赞详细技术贴。相比之下我实在太偷懒了。。。
quick question：用手甩怎么玩？甩到sink里？你有没有遇到过cross contamination的
问题？我老担心antibody跑到隔壁well里
【在 f*********r 的大作中提到】
: 说说要做好一个elisa，应该注意哪些小地方。
: 1，先检查硬件。读盘的分光光度计，盘子等等要说得过去。至少光路当中没有脏东西
: 。这个肉眼看看就行。或者每个well里加等量的水、pbs或者kit提供的稀释溶剂等去读
: 一读。它们相差不大，而且都小于标准曲线中最小的一个点的值就可以。
: elisa过程中，要冲洗几次。如果有多余的洗液残留在盘底，甚至干了以后有了印，可
: 能会有稍许影响。擦干净就好。
: 2，冲洗。说明书说洗几遍就几遍？别那么实诚。至少5遍。每次都用well能盛的最大量
: （大约400微升）。每次洗，都把前一次残留的甩干净。用手甩就行。或者在桌上垫纸
: 巾，扣着使劲拍。放心，特异性结合了的抗原、抗体是洗不掉的。多洗只有好处没坏处
: 。反正kit里洗液这一瓶永远有富余。
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f*********r
发帖数: 1233 | 8 对于常规elisa，2小时+2小时+半小时孵育，偷懒也就是五六个小时里减去十几分钟。
并不能整体缩短时间。
就是那么甩。就象擤鼻涕沾手上了那么甩（有点恶心）。但要注意，elisa的well都是
一条一条，活动的。握不紧的话，会甩掉。所以有的先人事前都标记好了。
不用担心污染问题。污染只会出现在加样时。加样完毕，就不会再污染了。第一次孵育
，理论上，所有的抗原就完全吸附在coated ab上（除非你的样品没有正确稀释，里面
抗原过量了）。这个时候，well里已经没有游离抗原了，你就是把各个well里的液体随
便混合也不会影响结果。
detecting ab根本不存在污染的问题。因为kit提供的抗体都是过量的。各个well里所
有抗原结合位点都被抗体占据了。就算加额外的抗体，也没有办法再与抗体结合。污染
的抗体，是游离的。一洗就全洗掉了。
以上只适合三明治elisa。
contamination的
【在 w******e 的大作中提到】
: 赞详细技术贴。相比之下我实在太偷懒了。。。
: quick question：用手甩怎么玩？甩到sink里？你有没有遇到过cross contamination的
: 问题？我老担心antibody跑到隔壁well里
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m******i
发帖数: 1204 | 9 好贴，顶
我有个问题：
冲洗这一步，如果用aspirate 液体，是不是要注意不能碰到底部？
【在 f*********r 的大作中提到】
: 说说要做好一个elisa，应该注意哪些小地方。
: 1，先检查硬件。读盘的分光光度计，盘子等等要说得过去。至少光路当中没有脏东西
: 。这个肉眼看看就行。或者每个well里加等量的水、pbs或者kit提供的稀释溶剂等去读
: 一读。它们相差不大，而且都小于标准曲线中最小的一个点的值就可以。
: elisa过程中，要冲洗几次。如果有多余的洗液残留在盘底，甚至干了以后有了印，可
: 能会有稍许影响。擦干净就好。
: 2，冲洗。说明书说洗几遍就几遍？别那么实诚。至少5遍。每次都用well能盛的最大量
: （大约400微升）。每次洗，都把前一次残留的甩干净。用手甩就行。或者在桌上垫纸
: 巾，扣着使劲拍。放心，特异性结合了的抗原、抗体是洗不掉的。多洗只有好处没坏处
: 。反正kit里洗液这一瓶永远有富余。
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f*********r
发帖数: 1233 | 10 碰，接触，没问题。不要划来划去。
【在 m******i 的大作中提到】
: 好贴，顶
: 我有个问题：
: 冲洗这一步，如果用aspirate 液体，是不是要注意不能碰到底部？
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o****e
发帖数: 1011 | 11 哪家的“盘”好些？Eppendorf的？
（或者哪里买plate都差不多？）
【在 f*********r 的大作中提到】
: 碰，接触，没问题。不要划来划去。
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