j******3
发帖数: 5244 | 1 最近想给蛋白浓度定量
但是浓度很低，大概0.1ug/ml左右的样子
试了下spectrophotometer和nano drop
好像灵敏度都不够
网上查了下bio-rad和pierce的kit，貌似下限都在2-5ug/ml
请教大家还有别的啥简单的办法，样品比较多
实在不想去做WB
thanks |
g*****y
发帖数: 6325 | 2 我不知道这个几个方法对你可行不，1. 将你的蛋白和不同浓度的standard比如BSA一起
跑胶然后silver stain. 之后用一般
胶stain的quantitation method 来粗略定量。 2. 将你的蛋白dialyze 到底盐或者
dh2o里。 lyophilize 成powder然后从
新溶解到small volume的buffer里来提高浓度再定量。
【在 j******3 的大作中提到】
: 最近想给蛋白浓度定量
: 但是浓度很低，大概0.1ug/ml左右的样子
: 试了下spectrophotometer和nano drop
: 好像灵敏度都不够
: 网上查了下bio-rad和pierce的kit，貌似下限都在2-5ug/ml
: 请教大家还有别的啥简单的办法，样品比较多
: 实在不想去做WB
: thanks
|
s******s
发帖数: 13035 | 3 millipore有脱盐浓缩的小柱子，挑个分子量cutoff低的，
大概就是加0.5ml, spin个30min, 倒扣在干净管子里spin
两分钟就行了，能浓缩二三十倍，够你用了
【在 j******3 的大作中提到】
: 最近想给蛋白浓度定量
: 但是浓度很低，大概0.1ug/ml左右的样子
: 试了下spectrophotometer和nano drop
: 好像灵敏度都不够
: 网上查了下bio-rad和pierce的kit，貌似下限都在2-5ug/ml
: 请教大家还有别的啥简单的办法，样品比较多
: 实在不想去做WB
: thanks
|
j******3
发帖数: 5244 | 4 谢谢
我也想这么做，
但自己老板没啥钱，
我一次就有36个样品，
实验估计要做十几二十次，还不算重复
老板不同意，想让我做WB，然后想办法定量
ft啊，果然人力不值钱
【在 s******s 的大作中提到】
: millipore有脱盐浓缩的小柱子，挑个分子量cutoff低的，
: 大概就是加0.5ml, spin个30min, 倒扣在干净管子里spin
: 两分钟就行了，能浓缩二三十倍，够你用了
|
j******3
发帖数: 5244 | 5 这个浓度的蛋白silver stain一般都看不见
如果dialyze再lyophilize的话，工作量太大了
几十上百个sample呢
【在 g*****y 的大作中提到】
: 我不知道这个几个方法对你可行不，1. 将你的蛋白和不同浓度的standard比如BSA一起
: 跑胶然后silver stain. 之后用一般
: 胶stain的quantitation method 来粗略定量。 2. 将你的蛋白dialyze 到底盐或者
: dh2o里。 lyophilize 成powder然后从
: 新溶解到small volume的buffer里来提高浓度再定量。
|
m**z
发帖数: 787 | 6 maybe absorbtion of the backbone? that should be very sensitive. but you
would need to calculate the extinction coefficient...
One way to do that maybe concentrate one of your sample, use that as a
standard to calculate the coefficient... that may work. Make sure everything
is in the same buffer though since some solvents will absorb at 220 nm or
so.
【在 j******3 的大作中提到】
: 这个浓度的蛋白silver stain一般都看不见
: 如果dialyze再lyophilize的话，工作量太大了
: 几十上百个sample呢
|
s********n
发帖数: 2939 | 7 那就做ELISA吧，96-well plate会快很多。 |
s******s
发帖数: 13035 | 8 透析再抽干，其实不麻烦，只要你的蛋白够稳定就行了。
买根tube，几十个样品也就一个小时就装完了，剩下的就是
放在buffer里面stir，换buffer, 抽出来真空离心，时间
虽然长，但是都不用人看着，动手时间也就两三个小时。
【在 j******3 的大作中提到】
: 这个浓度的蛋白silver stain一般都看不见
: 如果dialyze再lyophilize的话，工作量太大了
: 几十上百个sample呢
|
N2
发帖数: 81 | 9 0.1ug/mL 的样品,要定量,看起来是太低了.没有什么好方法准确定量.
LZ是什么样品?.其实用WB,是很快的, 尤其是很多样品.用semi-dry转膜,用SNAP-id 做
hybrid.但也只是一个估计.
【在 j******3 的大作中提到】
: 最近想给蛋白浓度定量
: 但是浓度很低，大概0.1ug/ml左右的样子
: 试了下spectrophotometer和nano drop
: 好像灵敏度都不够
: 网上查了下bio-rad和pierce的kit，貌似下限都在2-5ug/ml
: 请教大家还有别的啥简单的办法，样品比较多
: 实在不想去做WB
: thanks
|
N2
发帖数: 81 | 10 这点蛋白,还不够膜沾啊.0.1ug/ml, 用colormetric method的话,至少也得有几ug,LZ得
有几十mL的样品才够测一个点.
【在 j******3 的大作中提到】
: 谢谢
: 我也想这么做，
: 但自己老板没啥钱，
: 我一次就有36个样品，
: 实验估计要做十几二十次，还不算重复
: 老板不同意，想让我做WB，然后想办法定量
: ft啊，果然人力不值钱
|
|
|
c*********r
发帖数: 1312 | |
j******3
发帖数: 5244 | 12 多谢大家回复
我的样品体积大概500ul，所以其实总量也比较少
但是我不需要定绝对量
我只需要比较不同样品之间的相对量就可以了
目前看来可能elisa是比较方便的选择 |
j******3
发帖数: 5244 | 13 一共可能100ng不到的蛋白
这样折腾下来是不是都没了？
没有经验
【在 s******s 的大作中提到】
: 透析再抽干，其实不麻烦，只要你的蛋白够稳定就行了。
: 买根tube，几十个样品也就一个小时就装完了，剩下的就是
: 放在buffer里面stir，换buffer, 抽出来真空离心，时间
: 虽然长，但是都不用人看着，动手时间也就两三个小时。
|
s******s
发帖数: 13035 | 14 那是呀，所以原来建议你用小柱子
【在 j******3 的大作中提到】
: 一共可能100ng不到的蛋白
: 这样折腾下来是不是都没了？
: 没有经验
|
j******3
发帖数: 5244 | 15 直接上wb肯定是不行的
我现在做了下预试验，从200ul里面用TCA把蛋白沉淀下来
然后全load到page gel里，这样wb是可以比较容易检测到的
我现在的想法是能不能找个啥软件，能够根据WB条带的浓度来进行个初略的定量
我知道这样不准，但是想先试试
不知道有没有这样的软件
【在 N2 的大作中提到】
: 这点蛋白,还不够膜沾啊.0.1ug/ml, 用colormetric method的话,至少也得有几ug,LZ得
: 有几十mL的样品才够测一个点.
|
j******3
发帖数: 5244 | 16 唉，没办法
和老板谈过了
不同意
【在 s******s 的大作中提到】
: 那是呀，所以原来建议你用小柱子
|
