r*********y
发帖数: 124 | 1 我做M2 FLAG IP后的蛋白在0.5mg/ml 3XFLAG 室温1小时可以很好的 洗下来（4ml 洗脱
体积)。在跑胶之前需要除去过量的3XFLAG,同时把体积浓缩到100-150ul。我先用GE
G25 gel filtration column除去3XFLAG, 然后用vivan spin 6浓缩，发现还有很多
3FLAG在样品里。
另外我的样品在浓缩之后很粘，上样的体积加大后胶就跑的很慢还smeared（我的bait
蛋白最多200ng)。所有纯化，浓缩都用同样的buffer, 20mMTris pH7.5, 150NaCL, 10%
Glycerol, 1%NP-40, 1mM DTT, 1mM EDTA.我想请教高手;
(1) 如何除去多余的3FLAG
(2)如何避免浓缩是样品过粘影响跑胶。
谢谢 | a*****n
发帖数: 2835 | 2 没有必要去除FLAG吧？跑到胶里面自然就跑出去了
样品不浓缩试试？样品太粘的话说明蛋白浓度过大
bait
10%
【在 r*********y 的大作中提到】
: 我做M2 FLAG IP后的蛋白在0.5mg/ml 3XFLAG 室温1小时可以很好的 洗下来（4ml 洗脱
: 体积)。在跑胶之前需要除去过量的3XFLAG,同时把体积浓缩到100-150ul。我先用GE
: G25 gel filtration column除去3XFLAG, 然后用vivan spin 6浓缩，发现还有很多
: 3FLAG在样品里。
: 另外我的样品在浓缩之后很粘，上样的体积加大后胶就跑的很慢还smeared（我的bait
: 蛋白最多200ng)。所有纯化，浓缩都用同样的buffer, 20mMTris pH7.5, 150NaCL, 10%
: Glycerol, 1%NP-40, 1mM DTT, 1mM EDTA.我想请教高手;
: (1) 如何除去多余的3FLAG
: (2)如何避免浓缩是样品过粘影响跑胶。
: 谢谢
| r*********y
发帖数: 124 | 3 不浓缩做WB没问题。样品里有总共2mg的3FLAG, 不除去交胶都跑不动。Bait蛋白浓度太
稀，我想 都上到一个well里，在送去做mass spec.
在 ankyrin (漂泊Boston) 的大作中提到: 】 |
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