w*e
发帖数: 740 | 1 最近想做一个flag tag的knockin，看文献都觉得3xflag的效果好的多，想用3xflag。
但比较以后发现（sigma）网站，3xflag的序列并不是1xflag的三倍串联。而且1xflag
是8个氨基酸，而3xflag好像只有22个氨基酸/
不是很明白为什么不是24个氨基酸（而且是3个8aa的串联）？谁能解释一下？
谢谢 |
|
r*********y
发帖数: 124 | 2 我做M2 FLAG IP后的蛋白在0.5mg/ml 3XFLAG 室温1小时可以很好的 洗下来（4ml 洗脱
体积)。在跑胶之前需要除去过量的3XFLAG,同时把体积浓缩到100-150ul。我先用GE
G25 gel filtration column除去3XFLAG, 然后用vivan spin 6浓缩，发现还有很多
3FLAG在样品里。
另外我的样品在浓缩之后很粘，上样的体积加大后胶就跑的很慢还smeared（我的bait
蛋白最多200ng)。所有纯化，浓缩都用同样的buffer, 20mMTris pH7.5, 150NaCL, 10%
Glycerol, 1%NP-40, 1mM DTT, 1mM EDTA.我想请教高手;
(1) 如何除去多余的3FLAG
(2)如何避免浓缩是样品过粘影响跑胶。
谢谢 |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 3 请问有人用过3xFlag做CHIP－Seq么？可以给个Protocol么（未经许可，不会传阅）？
多谢 |
|
V******t
发帖数: 444 | 4 我打算构建一个C端带3XFlag－2XHA tag的序列，请问之间需要spacer吗？还有，我的
目的蛋白和Flag事直接融合，还是也要加一点spacer？
谢谢！！ |
|
Z******t
发帖数: 206 | 5 想用来标记蛋白做免疫共沉，不知道有没有人比较过3xFLAG和3xHA 哪个好用？ |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 6 经过前面大牛的指点，决定加3xflag。请问加的时候需要和基因之间有一段Buffer序列
么（比如Sigma载体里的MCS区域，基因－NNNNNN－3xflag），还是可以直接设计引物让
二者直接紧邻（基因－3xflag）？多谢 |
|
y******8
发帖数: 1764 | 7 3xFlag is about 10x stronger than 1xflag. 3xflag peptide elution is
about 50% of recovery.
If just for Mass Spec, acidic elution is good and complete. |
|
|
|
s*********y
发帖数: 292 | 9 我在做一个蛋白，目前只有一个能用的蛋白抗体，能做western，无法IP或者IF。在老
板的建议下，我用CRISPR在我做的那个基因的后面加了3XFLAG tag。拿到这个内源
3XFLAG的细胞之后，用sigma m2抗体做western，可以杂到非常弱的条带（跟蛋白的抗
体差10倍左右）；m2的beads可以做IP。qPCR的话，跟actin比，大概差了七八个循环。
我感觉就是我这个蛋白表达量太低了。而且FLAG抗体也没想象中的那么好，只不过大家
一直用它做过表达，所检测的蛋白浓度高所以感觉很好而已。
现在的问题是，用FLAG抗体去做immunofluorescence，基本没有信号。抗体加浓了，
control的细胞（无任何内源的FLAG）也能染上。请问这种情况应该怎么处理？ |
|
a*****n
发帖数: 2835 | 10 没有必要去除FLAG吧？跑到胶里面自然就跑出去了
样品不浓缩试试？样品太粘的话说明蛋白浓度过大
bait
10% |
|
r*********y
发帖数: 124 | 11 不浓缩做WB没问题。样品里有总共2mg的3FLAG, 不除去交胶都跑不动。Bait蛋白浓度太
稀，我想 都上到一个well里，在送去做mass spec.
在 ankyrin (漂泊Boston) 的大作中提到: 】 |
|
a***e
发帖数: 1010 | 12 3xFLAG is my favorite. Sigma has the best antibody for it. |
|
h*****n
发帖数: 2023 | 13 最近在研究一个很大的蛋白，有2500个氨基酸。我在这个蛋白的N端加了个FLag。筛了
稳定表达细胞系，用FLAG抗体检测不到蛋白的表达，但我用这个蛋白本身的抗体可以检
测到很强的信号。我以为FLAG序列没有表达，然后就做了FLAG IP，接着用蛋白本身的
抗体看看FLag能否沉下蛋白，结果发现FLAG能能沉下蛋白，比INPUT多。因为实验需要
，只能用1xFLAG,而不能用3XFLAG.FLAG抗体做IP比western灵敏吗？为什么我的western
检测不到？ |
|
p******i
发帖数: 1092 | 14 我猜在related products里面吧……
你去addgene买个3XFLAG的CMV promoter的plasmid，最好蛋白size也和你做的差不多，
自己做transfection…… |
|
m******5
发帖数: 1383 | 15 贴上来确认一下…… 一个knock in要大半年才能拿到，怕有什么意外问题 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 16 expression ... none could guanrantee |
|
j*b
发帖数: 341 | 17 no problem.
check your mail. |
|
m******5
发帖数: 1383 | 18 我安全起见，在这个tag和我的蛋白间+了8个glycine做linker，因为问题不大吧？ |
|
j*b
发帖数: 341 | 19 Nature. 2010 Jan 21;463(7279):374-8.
Transcriptional role of cyclin D1 in development revealed by a genetic-
proteomic screen.
Abstract
Cyclin D1 belongs to the core cell cycle machinery, and it is frequently
overexpressed in human cancers. The full repertoire of cyclin D1 functions
in normal development and oncogenesis is unclear at present. Here we
developed Flag- and haemagglutinin-tagged cyclin D1 knock-in mouse strains
that allowed a high-throughput mass spectrometry approach to search for
... 阅读全帖 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 20 Thank you, I am at home………… Did they actually add any linker? |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 21 看了看，原来pathwayA & pathwayB 的根部，或者说Y 型的分支的根部 是你的蛋白作
用的地方，也可能是个complex
找一些抗体，做个简单的coIP， 或者做TAP+MS （按照我的经验，一次3xflag
affinity purification也可以的，只要对照好，MS好。TAP损失很多，细胞量不够，
complex弱，都做不动的）。还有mutant protein co-IP，这些都不用废话说的。。。
。。。。。
另外要提醒，在signal pathway里面，蛋白之间都是touch-off的形式，捞不到stable
complex。
GST fusion去捞complex，特别是膜泡蛋白，非常脏，出来无数的东西。 |
|
r*********y
发帖数: 124 | 22 第一步IP用3XFLAG peptides洗脱之后，要不要先除去FLAG peptide，再做第二步IP？
谢谢 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 23 四个d那个版本其实很糟糕，最好的是3xflag第一个或者第二个不带酶切位点的
抗体m2不错 |
|
c********u
发帖数: 250 | 24 所以myc his都不好，那剩下的HA，V5 和 3xFLAG差不多吗？ |
|
m******5
发帖数: 1383 | 25 1, 87base没有问题，设计一个长引物而已
2,3Xflag是由一个经典flag+两个mutant flag组成，后两个flag仍然可以被大多数
Sigma Flag antibody识别，第一个经典flag可以被所有市售flag antibody识别
3,尽量用N-terminal Flag，能识别C-terminal Flag的抗体相对少很多，选择会收限制 |
|
S*********s
发帖数: 304 | 26 // non-denature Tandem purification
3XFLAG + HA
or
ProteinA beads(IgG domain)+HA/FLAG
His or myc affinity and specific 不够~
//denature purification
His and biotag 会比较好~ |
|
M********r
发帖数: 142 | 27 pls refer http://www.nature.com/ncb/journal/v15/n4/full/ncb2702.html?WT.ec_id=NCB-201304
most important is ab.
Yi Zhang used F7452 sigma. nobody won't trust yi zhang ..
ChIP-seq sample preparation.
For Kdm2b ChIP, Kdm2b Flag-tag knock-in mESCs were fixed with 2 mM
ethylene glycol bis(succinimidylsuccinate) (Thermo Scientific) for 1 h
, followed by 10 min in 1% formaldehyde and 5 min in 0.125
;M glycine to sequence the reaction. Cells were lysed in 1% SDS, 10 ... 阅读全帖 |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 28 Many thanks. Baozi Sent.
Does anyone know whether the M2 antibody works for Flag CHIP?
;h
8201;
mM
to |
|
M********r
发帖数: 142 | 29 no no no never M2 beads.
I compared and it never works.
2 reasons
1. ChIP buffer contains SDS and SDS kills M2 beads (refer to M2 beads
handbook)
2. you never know how much antibody you used. 10 ul of M2 beads perhaps
contain hundreds ug of ab. and saturate your chromatin. you need titration,
but impossible.
you may want to try M2 antibody which is a monoclonal antibody and the same
as the one conjugated with M2 beads.
You could buy M2 antibody and F ... polyclonal antibody and use both. you
c... 阅读全帖 |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 30 Very helpful. 2 more baozi sent
titration,
same |
|
a*******a
发帖数: 4233 | 31 3个1*的串联以后如果用beads纯化是洗脱不下来的。
我们犯过这种低级错误
1xflag |
|
M*P
发帖数: 6456 | 32 为什么说是低级错误？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
|
|
|
s*********y
发帖数: 292 | 35 几个月前第一次做，3Xflag knockin，挑了20个克隆有俩
从那之后knockin就再也没成功过
knockout感觉确实挺好做的 |
|
w*e
发帖数: 740 | 36 sigma has such vectors with sequence on line, you can check how they make it
. |
|
发帖数: 1 | 37 肯定flag更好啊
最好用3xflag
可以没有igG
input最好有
实在没有也行 |
|
s*****i
发帖数: 315 | 38 我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位序列
转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
多了
里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
SV40NLS
我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
韩paper里的G10，下周再试一次
如果有结果我会post 出来的。 |
|
r********s
发帖数: 149 | 39 刚刚看到Addgene已经有他们的质粒了，发现c-terminus多出几个氨基酸。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
序列
:转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
:多了
:里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
:SV40NLS
:我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
了韩paper里的G10，下周再试一次
:如果有结果我会post 出来的。
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
|
r********s
发帖数: 149 | 40 刚刚看到Addgene已经有他们的质粒了，发现c-terminus多出几个氨基酸。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
序列
:转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
:多了
:里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
:SV40NLS
:我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
了韩paper里的G10，下周再试一次
:如果有结果我会post 出来的。
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
|
