e********r
发帖数: 147 | 1 细菌里有个测序后annotated的基因（编码一个还原酶），我们有RT-PCR的证据表明这
个基因不但有正义的mRNA转录，同时也有反义的非编码RNA转录，原以为应该是个作用
于自身的cis-encoded antisense RNA，很感兴趣打算继续分析下去。
用大肠杆菌表达了这个基因的产物（表达量那叫一个高），制备了抗体以后做Western
（多抗那叫一个好），呵呵，现在麻烦出来了：至少在我们目前的诱导条件和上样量（
15 μg总蛋白）下，在该细菌里一点都没检测到这个蛋白的表达。难到它是个假基因？
那转录正义和反义干啥？这个东西自已觉得很有趣，对于如何开展下一步，请大家帮忙
出出主意，谢了先！ |
h****r
发帖数: 152 | 2 我很好奇,不做northern,只做RT-PCR怎么知道这个基因即有正义的又有反义的mRNA?
如果真是同时有正反义mRNA，翻译肯定受抑制啊，没有蛋白也很正常。
Western
【在 e********r 的大作中提到】
: 细菌里有个测序后annotated的基因（编码一个还原酶），我们有RT-PCR的证据表明这
: 个基因不但有正义的mRNA转录，同时也有反义的非编码RNA转录，原以为应该是个作用
: 于自身的cis-encoded antisense RNA，很感兴趣打算继续分析下去。
: 用大肠杆菌表达了这个基因的产物（表达量那叫一个高），制备了抗体以后做Western
: （多抗那叫一个好），呵呵，现在麻烦出来了：至少在我们目前的诱导条件和上样量（
: 15 μg总蛋白）下，在该细菌里一点都没检测到这个蛋白的表达。难到它是个假基因？
: 那转录正义和反义干啥？这个东西自已觉得很有趣，对于如何开展下一步，请大家帮忙
: 出出主意，谢了先！
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e********r
发帖数: 147 | 3 不好意思，这个RT-PCR实验有点粗，是分别用sense和antisense引物去做cDNA第一链的
合成，然后再做PCR。这样可以分别检测antisense和sense的RNA产物。应该用Northern
进一步验证的。
这个antisense能把翻译统统都block掉，也太牛了....
我是不是应该试试其它的培养条件，或者想办法阻止antisense的转录什么的？ |
s******y
发帖数: 28562 | 4 Indeed it is very interesting.
It is possible that the antisense RNA was used in the bacteria
to block the expression of the sense mRNA. Therefore only in certain
condition that this inhibition would be released to express the sense mRNA.
Western
【在 e********r 的大作中提到】
: 细菌里有个测序后annotated的基因（编码一个还原酶），我们有RT-PCR的证据表明这
: 个基因不但有正义的mRNA转录，同时也有反义的非编码RNA转录，原以为应该是个作用
: 于自身的cis-encoded antisense RNA，很感兴趣打算继续分析下去。
: 用大肠杆菌表达了这个基因的产物（表达量那叫一个高），制备了抗体以后做Western
: （多抗那叫一个好），呵呵，现在麻烦出来了：至少在我们目前的诱导条件和上样量（
: 15 μg总蛋白）下，在该细菌里一点都没检测到这个蛋白的表达。难到它是个假基因？
: 那转录正义和反义干啥？这个东西自已觉得很有趣，对于如何开展下一步，请大家帮忙
: 出出主意，谢了先！
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s******y
发帖数: 28562 | 5 Onething you can try first, is to co-transform E.coli with a plasmid
containing the sense mRNA and another plamid containing the antisense RNA,
and see if this antisense RNA can also inhibit the expression of the protein
in E.coli.
Northern
【在 e********r 的大作中提到】
: 不好意思，这个RT-PCR实验有点粗，是分别用sense和antisense引物去做cDNA第一链的
: 合成，然后再做PCR。这样可以分别检测antisense和sense的RNA产物。应该用Northern
: 进一步验证的。
: 这个antisense能把翻译统统都block掉，也太牛了....
: 我是不是应该试试其它的培养条件，或者想办法阻止antisense的转录什么的？
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e********r
发帖数: 147 | 6 You are right, may be I'll try this experiment.
protein
【在 s******y 的大作中提到】
: Onething you can try first, is to co-transform E.coli with a plasmid
: containing the sense mRNA and another plamid containing the antisense RNA,
: and see if this antisense RNA can also inhibit the expression of the protein
: in E.coli.
:
: Northern
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h****r
发帖数: 152 | 7 用pcr引物去做RT是挺粗的，PCR的引物一般都很长，而RT的反应温度比较低，如果你的
sense引物的3'端GC含量稍微高点就会有非特异性的配对。不信你可以用其他基因的引
物在你的sense引物合成的cDNA第一链中扩增试试，也许也可以扩增出来。
Northern
【在 e********r 的大作中提到】
: 不好意思，这个RT-PCR实验有点粗，是分别用sense和antisense引物去做cDNA第一链的
: 合成，然后再做PCR。这样可以分别检测antisense和sense的RNA产物。应该用Northern
: 进一步验证的。
: 这个antisense能把翻译统统都block掉，也太牛了....
: 我是不是应该试试其它的培养条件，或者想办法阻止antisense的转录什么的？
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e********r
发帖数: 147 | 8 没错，存在你说的这个可能，应该用northern看一看的。
不过这个所谓antisense的发现是这个样子的：用RT-PCR验证操纵子结构时，发现5'端
基因的转录未终止，延伸到了3'端的另一个基因区域内，而这个3'端基因的转录方向却
和5'端那个完全相反，所以猜测多延伸出来的这部分要么是5'端基因的3'-UTR，要么是
3'端基因的antisense。正是如此所以觉得有趣想往下面做着看一看，毕竟现在non-
coding RNA是个热门领域，呵呵。
谢谢提醒！
【在 h****r 的大作中提到】
: 用pcr引物去做RT是挺粗的，PCR的引物一般都很长，而RT的反应温度比较低，如果你的
: sense引物的3'端GC含量稍微高点就会有非特异性的配对。不信你可以用其他基因的引
: 物在你的sense引物合成的cDNA第一链中扩增试试，也许也可以扩增出来。
:
: Northern
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g*****y
发帖数: 6325 | 9 这个northern 一定要做。 至少也做个real-time pcr。 做northern也看看sense和
anti-sense的half-life有什么区别。还有看看RNA有没有和某些蛋白结合。 |
e********r
发帖数: 147 | 10 好主意
【在 g*****y 的大作中提到】
: 这个northern 一定要做。 至少也做个real-time pcr。 做northern也看看sense和
: anti-sense的half-life有什么区别。还有看看RNA有没有和某些蛋白结合。
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