s********2
发帖数: 138 | 1 谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
。望大家见谅。 |
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k*******s
发帖数: 214 | 2 这是sequencing PCR reaction根本没有开始，有几个可能
1. 你的引物的Tm太低，在同样退火温度下，引物没有结合好。
2. 模板的溶度太低。
3. 模板样品里面有抑制PCR反应的物质，比如EDTA
另外BigDye很稳定，自带的对照肯定能做出来，因为样品最纯的，引物M13也是最常用
的，本身做这个对照没有意义。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。注： 后面有结果图片。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 3 了解你的考虑和选择
我只是从原理上回答你原本的问题，回收片段测序没有任何问题，这也是公司会这么和
你表态的原因，而不是你们测序中心表现出的那样问题重重风险大大，也有可能误导后
人。
花钱不花钱确实没啥可考虑的，不过片段测不出的，构建到质粒上也同样可很可能测不
出，序列性质决定的。至于浪费时间精力什么的，克隆到载体上一样面临着未知的风险
，尤其对于重复序列而言，如果是我我不会让事情复杂化，至少，如果真的觉得这个结
果很重要的话，两条路并进。
祝好运了 |
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w*****i
发帖数: 54 | 4 50×测序深度
是啥意思啊？ 是不是数字越大代表获得的信息越多？
还有，经常说到44M， 这个是测序结果的信息量44mega 吗？
求解 |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 测序都是鸟枪法，也就是黑布袋里随便抓一段DNA测，测完再去抓。
1x意思就是100m的genome，你测序总量也到了100m, 但是实际上必然
很多序列测了多次，很多序列没测到。一般看genome 30x是至少，
做到50x甚至100x都可能。 |
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d*******e
发帖数: 110 | 6 J. Bacteriol 上关于测序的文章几乎占了三分之一，大家觉得正常么？找个细菌就测
一通，发个JB，那像华大基因这样的专业测序公司，一年不得发个几十片JB啊，你看德
国大肠杆菌事件，不到一周就搞定了全基因组。以前觉得这个J. Bacteriol很牛的，现
在IF4.0都不到了，大伙能说说怎么回事么/ |
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s********2
发帖数: 138 | 7 对呢，现在这个实验室没有服务器，我国内导师的实验室有服务器，我就是想拿到初步
数据，再做实验，再测序，然后将最后的测序结果拿到国内分析就行了，但是现在就卡
在这个初步结果的分析这步上了。并且，我还想赶紧做完，赶紧回国。 |
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b*******e
发帖数: 288 | 8 看他什么方向呀？
现在很多实验室搞测序，都是超高劳动密集型工作，拿到测序后的分析琐碎又机械，几
乎全靠人工
我硕士的时候做过基因注释，眼镜度数涨得刷刷的，实在是得不偿失啊……那个时候真
的是心情最低落的时候，真的是拿健康做无意义的浪费。
稍微跟电脑沾点边的东西，都敢打着生物信息学的旗号招摇撞骗。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 9 尝试一下阿，最早的测序是化学法，这个我把怎么测得忘了，也从未用过。然后就是大
规模应用也是最重要的双脱氧法。
打个比方，DNA是一条长链，好比一条长绳子，这个绳子上打上了很多的结，结虽然很
多，但是细细一下只有四种，分别是A T C G，有聪明人想出了妙招让这四种不同的结
各发不同的光，然后呢只要从头到尾的按顺序收集这些不同的光，就能读出这个绳子上
结的排列顺序了，也就完成测序了。
当然现在又有下一代的方法，我也不甚明白的 |
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D*a
发帖数: 6830 | 10 为啥lz最近对测序感兴趣？难道需要用到测序了。。。
( > _ < ) |
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g*****n
发帖数: 241 | 11 我想测序的那个Gateway vector在我插入片断之前的序列高度AT rich，大概前180个碱
基里面AT含量高达80%。请问除了设计反向引物，其它有没有什么办法测序啊？谢谢 |
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j*****d
发帖数: 787 | 12 测序癌细胞倒没错，错在他的偏执。通过CT查出癌细胞后8个月里，因为他的think different的偏执，拒绝正常治疗，错失治愈的机会。
好奇是不是genetech的主席Art Levinson出的主意测序他的癌细胞？这个序列对他个人
的治疗的确没有太大的实际性意义吧，对做研究倒有那么一点。 |
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d*******j
发帖数: 64 | 13 首先，你需要matched normal，比如此病人的白细胞或正常组织DNA。如果你是给这个
病人服务，那你只要找到这个sample的somatic mutation就可以，有可能成为治疗的靶
或者检测病情的marker。如果你要研究这个rare cancer type，那至少需要8-10对样品
，找找有没有什么新的基因在多个样品中都有突变。genomic测序的话不需要那么高的
coverage，如果只是找突变的话做exome测序也可以。
义? |
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M*******C
发帖数: 183 | 14 同一个DNA样品，根据vector map，T3, T7 两个方向测序，primer都是测序中心提供。
T3的结果正常，T7却NO band, NO data。 再测一次，还是这样。
大家觉得这是怎么回事？thx |
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s****l
发帖数: 10462 | 15 叫什么度先不管，就是那个意思
~~~~~~~~~~~~~~~~~你这个说法很显然经不住推敲啊，老兄，如果你说的提高的是我指
的测序本身的准确度，而不是指第三个染色体上的第一百个碱基我现在更有10000倍高
的把握肯定它是C.我指的是测序技术本身。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 16 illumina 454也都有错误也都不能轮回测同一个分子啊。只要某些DNA片段不会选择性
的不能通过那个pore，很难想象在足够多coverage后还会有大的gap。
nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
可能是氢键吧
难道你以为是单细胞测序？不是的啊，打比方他说把血液直接加上去，血液里那么多白
细胞，每个里面都有两个copy的基因组 |
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f*******e
发帖数: 628 | 17 一般的 sample amplification 是把一个单分子原始 DNA 在一个 bead （或者其他介
质）上扩增成序列一样的的足够多数量的分子。 这个过程产生的 error 很小，比如 <
0.1%, 可以忽略不计。说这个过程可以纠正 error, 是因为在后续 sequencing 的时候
是读取的 amplification 之后整体产生的信号，所以即使这个集合里面某些少量的分
子产生错误的信号, 也淹没在 noise 里，不影响集合读出的正确序列.
相比较之下，single molecule 的方法只读取一个原始分子的信息，比如 nanopore,
读错了就错了，没有这么一个纠正的机制，所以就只能靠大量的 coverage 来弥补。
根据 nanopore 的网站，他们用某种 dsDNA binding enzyme 在 nanopore 的端口来
unzip double strand, 所以最后通过 pore 读取的是 single stranded
trinucleotide。一个分子被测序之后不会回来反复被测。所以要靠测序的 coverage
来弥补错误的话，就需... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 18 关于3，你是技术更新了老的方法都忘了。在next gene之前，用测序测表达，
就把cDNA加接头，然后切成固定大小片段，然后几十个ligate在一起，作为
一个反应去测序。nanopore显然可以用这样的方法，也就是样品要处理一下
而已，这个比library还是简单
板？ |
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f*******e
发帖数: 628 | 19 有这个瓶颈的话，应该是长的 DNA 才更难进入。
大概影响速度的瓶颈在目标分子到达 pore 所需要的时间，之后真正测序反而很快。所
以分子长的话，一旦碰到一个可以一直测序很长一段，每个 pore 的利用效率高。分子
短的话，读过之后又要闲置等待下一个分子进入。 |
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I***W
发帖数: 218 | 20 个人认为：蛋白从头测序最有可能的解决方法是Nanopore，但现在Nanopore的技术还处
于初始阶段，用于DNA测序已经由公司在做，号称年底能有样机出来，等DNA/RNA解决了
，就是protein了。 |
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a**m
发帖数: 184 | 21 BGI测序要帮你分析的，然后会霸占一作甚至通讯作者
Illumina (solexa) 要patent的，大部分人付不起 |
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q****r
发帖数: 26 | 22 从我的经验来看，做结构算法的需要很强的物理和数学知识，没有多少年的沉淀很难独
立开发新算法和软件。通常大型软件如蛋白结构预测软件rosetta，分子模拟软件amber
都需要多个groups联合开发十几年。最重要的是目前蛋白结构相关软件的精度还太差，
还不能足以指导实验研究，所以用处不大。并且能够再做的新领域不多，因此感觉短期
来看这个方向没有什么大的发展前途了。
测序就不太一样，数据分析是必不可少甚至比本身的实验还重要的一环。感觉做序列分
析的地位要比做结构信息学得高好多。搞结构信息学说实在可有可无，但做序列分析的
却不可缺少。而且测序的应用远远强于做结构，能够直接跟疾病，遗传，发育等关联，
感觉用处很大。目前就是苦于没有办法转到NGS这个领域，主要是没有机会去做这个领
域的东西。所以希望大家能给点建议。 |
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q****r
发帖数: 26 | 23 从我的经验来看，做结构算法的需要很强的物理和数学知识，没有多少年的沉淀很难独
立开发新算法和软件。通常大型软件如蛋白结构预测软件rosetta，分子模拟软件amber
都需要多个groups联合开发十几年。最重要的是目前蛋白结构相关软件的精度还太差，
还不能足以指导实验研究，所以用处不大。并且能够再做的新领域不多，因此感觉短期
来看这个方向没有什么大的发展前途了。
测序就不太一样，数据分析是必不可少甚至比本身的实验还重要的一环。感觉做序列分
析的地位要比做结构信息学得高好多。搞结构信息学说实在可有可无，但做序列分析的
却不可缺少。而且测序的应用远远强于做结构，能够直接跟疾病，遗传，发育等关联，
感觉用处很大。目前就是苦于没有办法转到NGS这个领域，主要是没有机会去做这个领
域的东西。所以希望大家能给点建议。 |
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j**********0
发帖数: 391 | 24 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
问题。
如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
多谢。 |
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d**********2
发帖数: 12 | 25 中山大学中山眼科中心是国家985重点大学中山大学的附属医院, 为国家三级甲等医院
，是国内唯一的眼科学国家重点实验室的依托单位。 因工作需要，眼科学国家重点实
验室转化系统生物学实验室现招聘计算类和实验类科研人员若干名，具体职位包括(1)
副教授(2)博士后。
实验室简介：
转化系统生物学实验室(Laboratory for Translational Systems Biology)试图用计算
结合实验的手段从系统水平探索人体疾病机理。我们通过高通量测序和计算生物来分析
人类基因组，转录组，结合临床数据，建立生物及疾病网络，分析疾病和正常人体的差
异性。实验室将以眼科疾病作为主要研究对象，所开发的计算和实验手段也会应用到其
他非眼科疾病。实验室大型设备包括大型电脑计算服务器(理论峰值计算能力11万亿次)
和高通量测序仪。
实验室负责人：
谢志教授现任中山大学眼科学国家重点实验室转化系统生物学实验室负责人。原任美国
国家癌症研究院研究员(Investigator)，有医学和计算双重背景，长期从事系统生物学
研究。2012年获得第三批国家“青年千人计划”资助。以第一作者和通讯作者发表的文... 阅读全帖 |
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T**********2
发帖数: 38 | 26 曾经银染过测序胶的路过。
手工测序，制胶、跑胶、显影（同位素或非放）都不是问题，真正难的是读序，尤其是
读到密集的地方，有时还有band compression, G4 trap等。一个反应要读出尽可能长
的序列，往往读花了眼。 |
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T**********2
发帖数: 38 | 27 曾经银染过测序胶的路过。
手工测序，制胶、跑胶、显影（同位素或非放）都不是问题，真正难的是读序，尤其是
读到密集的地方，有时还有band compression, G4 trap等。一个反应要读出尽可能长
的序列，往往读花了眼。 |
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s****l
发帖数: 10462 | 28 帮不了什么，虽然我是做测序相关的，只能祝福一下。
感慨一下：
我们每个人做的都只是一个方面的一个点，但是从测序开始到病因确诊到最后的治疗，
中间太多太复杂。生物医学还有太多的需要发展。保守估计至少还要10年，才能看到测
序在医疗诊断上大规模的应用。 |
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m****c
发帖数: 244 | 29 BCM exome测序对Mendelian疾病的检出率只有25%。small indel，tandem repeat 都
call不好。并且抓exome的时候会丢掉一部分，所以覆盖不全。建议：
1）TCH的检测实验室可以做lipid panel，只抓lipid相关的exome，抓不到的会sanger
测序补上。你可以去试试。
2）做high coverage 的 whole genome sequencing，父母孩子一起做，call de novo
mutation，但这是一个科研问题了。并且可能要做细致的de novo assembly，耗时长，
没有成熟的pipeline。我们在做这方面的研究，但遗憾的是还不能立刻用。
祝福孩子！
MCT
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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b****r
发帖数: 17995 | 31 你是说21三体之类的？
下代测序对比较长的trinucleotide repeat之类的测序准确性比较差，加上mapping的
时候因为NGS本身的缺陷也容易出错，所以不是最好的方法。做STR需要准确的话还是用
专门的酶和引物效果比较好
如果测准了，做三体当然是没问题的，事实上我在临床上都碰过几次做STR发现是三体
的情况 |
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m*********e
发帖数: 533 | 32 请问对于genome center或者测序公司会有什么影响？ |
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f*******a
发帖数: 671 | 33 我以前有一次本来自己用bioanalyzer测得perfect的sample,送测序公司就降解了,也有
可能是运输或者测序公司操作不当. |
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h******u
发帖数: 602 | 34 一种干细胞血液疾病，预后很差。想测序看看能不能挖出有兴趣的致病基因突变。
请问大家都用那家做whole genome or Exon测序？
谢谢啦！ |
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c*********r
发帖数: 1312 | 35 同推荐BGI，还可以给你推荐1个特别积极的team。有问必答，还特别快。
当时我quote了几个熟悉的测序中心，就他家便宜而且最快能拿到数据。
不过要提醒一下，大笔的支付要先和purchasing department什么的联系一下，
paperwork可能会比测序都慢。。。 |
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s******r
发帖数: 1245 | 36 单细胞测序技术肯定是有意义的，但是技术能实现不代表就有应用
父母遗传病做胚胎检测根本不需要测全基因组，就算不计较成本，做完biopsy到决定要
不要implant最多也就两三天，现在的测序机器跑一下全基因组都不一定够，你还得加
上之前处理样品之后分析数据啥的，现在的技术得把成本和时间都大幅降下来才能考虑 |
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e****a
发帖数: 5 | 37 测序能有多少成本，这么多样品，和测序公司讲讲价就成本下来了，想要多少数据就测
多少数据，差不了多少钱。
大, |
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K******S
发帖数: 10109 | 39 测序不是问题，测出来有多少是druggable的？
：以前还有个蛋白测序，环在不提了？目前好象只用干研究，没啥实际用 |
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s******y
发帖数: 17729 | 40 华大倒是测得便宜，但是听说北美华大好像都快完犊子了。
也有听说送国内去测的，感觉不靠谱
中国的测序太多太杂了，一是不知道哪家强，二是对运输不放心。
因为测得比较多de novo，测基因组，所以不得不考虑价格。北美测序哪家强啊 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 41 GC 高的序列在测序反应里加点DMSO， 借以降低退火温度要求。通常测序公司会有阳
性对照来做质量控制，体系不会出大问题。你甚至可以要求他们把系统质量控制的结果
发给你。
nanodrop
technologies |
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T*****e
发帖数: 247 | 42 谢谢楼上各位的建议！
nchu：
protocol我不知道怎么让公司换。primer已经换过了还这样。RELP是什么？谢谢！
varianinccom：
他们就是质量控制发现绝大部分sample都很差。我在他家用了四年多了吧。这是第一次
这样大规模的出错。关键是这个测序的部分非常简单。invitrogen的pCR8GWTOPO，普通
的TOPO cloning vector。用通用的M13 primer测序，这个结合位点是在TOPO vector载
体上的。我只是插入PCR产物进去，跟引物结合位点还差了100bp以上呢。至于你提出的
加DMSO，我这种估计得专门跟他们沟通才敢加吧。
atwood：
我在他家以前一直也没啥问题，就最近两个星期。所以我才来这问的。不过你说没有问
题，那我再找找自己的原因。
extinguish：
有个别的sample用了free repeat了，还是不行。即使是测载体自身序列部分也有突变
。我就搞不明白这些突变是从哪来的了。
再次感谢大家的帮助！ |
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v**********m
发帖数: 5516 | 43 GC 高的序列在测序反应里加点DMSO， 借以降低退火温度要求。通常测序公司会有阳
性对照来做质量控制，体系不会出大问题。你甚至可以要求他们把系统质量控制的结果
发给你。
nanodrop
technologies |
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T*****e
发帖数: 247 | 44 谢谢楼上各位的建议！
nchu：
protocol我不知道怎么让公司换。primer已经换过了还这样。RELP是什么？谢谢！
varianinccom：
他们就是质量控制发现绝大部分sample都很差。我在他家用了四年多了吧。这是第一次
这样大规模的出错。关键是这个测序的部分非常简单。invitrogen的pCR8GWTOPO，普通
的TOPO cloning vector。用通用的M13 primer测序，这个结合位点是在TOPO vector载
体上的。我只是插入PCR产物进去，跟引物结合位点还差了100bp以上呢。至于你提出的
加DMSO，我这种估计得专门跟他们沟通才敢加吧。
atwood：
我在他家以前一直也没啥问题，就最近两个星期。所以我才来这问的。不过你说没有问
题，那我再找找自己的原因。
extinguish：
有个别的sample用了free repeat了，还是不行。即使是测载体自身序列部分也有突变
。我就搞不明白这些突变是从哪来的了。
再次感谢大家的帮助！ |
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发帖数: 1 | 45 听说韩春雨现在也在重复自己的实验，成百成百地送克隆出去测序。我想说的是，即使
看到一两个indel，也是不算数的。
我知道国内也有一两家实验室测几十上百个克隆的序，也是能看到indel的。
但是如果对不加任何处理的细胞测几十上百个克隆，我猜也是有可能看到一两个indel
的，这是实验本身的系统误差、背景噪声。所以实验组测的样本数量，对照组也得相应
有足够，而且要有充分的对照（不加NgAgo只加gDNA，以及什么都不加）。不然统计显
著性就过不去。
所以测序也不是标准，统计才是。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 46 PCR产物是300bp左右，电泳结果也正确，结果送去测序结果是五百多bp的序列。序列比
对之后发现后面多了段反向的重复序列。用Forward和reverse primer测序结果都是多
出一段反向的序列。请问这是为什么啊？谢谢！ |
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R*Z
发帖数: 114 | 47 最近要做RNA-seq，计划用Illumina Hiseq.问了几家公司，现在BGI 和 Novogene给的
价格比较优惠。有人用过这两家的服务么？测序的质量怎么样？他们两家都是要把材料
弄回中国去测序么？
谢谢了 |
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发帖数: 1 | 48 zz
我的故事说起来可能有点长，之前就有朋友希望我能把之前的一些经历写成一本书。今
天，我们可以来聊一聊其中几个有意思的故事。当时我在Lynx Therapeutics做高通量
测序相关的工作。2002年诺贝尔生理学与医学奖获得者悉尼·布伦纳(Sydney Brenner)
是我的指导者。他选择线虫作为实验生物模型，使得基因分析能够和细胞的分裂、分化
，以及器官的发育联系起来，并且能够通过显微镜追踪这一系列过程，他在英国剑桥完
成的这些为他获得诺贝尔奖奠定了基础。Sydney当时是Lynx 的首席科学家，在业内非
常受尊敬，Lynx的很多体系都是他在设计，我在Lynx 的一项工作就是和Sydney配合，
老先生的思维很活跃，有时候一天会有20多个想法，我的工作就是对这些想法“做减法
”，将能够产业化的想法实现。在他的领导下Lynx建立了一套完整的测序体系。
基因组学这个领域太有意思了。可惜在中国被饶毅等人刻意贬低抹黑了。 |
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r******f
发帖数: 987 | 49 我们现在测很多序列，但是都是准备好样品，送出去测，然后公司直接给报告，我们就
看报告。但是很想接触点测序结果的数据分析。路过的大侠给指点下做这个数据分析要
学什么软件呢？
听说要python，这个可以做测序结果的数据分析吗？但是貌似python并不是一种软件，
更像是一种语言，难道要自己编程？比较晕，求指点，多谢了。 |
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w*****t
发帖数: 179 | 50 有个亲戚的了肺癌，在国内做的手术，然后在国内做的几个靶基因测序结果什么都是阴
性，担心测得不太准确。样品托人带到了美国，想找美国的公司给测一下，但是问了几
个公司都需要有处方，想问一下有没有人知道不需要处方就可以给测序的公司呀？多谢
了。 |
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