s****l
发帖数: 395 | 1 我觉得是1*tag的问题，用3*tag应该好些，我表达一个1*HA tag的蛋白作stable line
，筛选的时候用HA的抗体根本没信号，用该蛋白的抗体可以看到比endogenous强的
shift band
western |
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v***a
发帖数: 1242 | 2 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
胞膜上。
最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
缘故。
两个单抗都是raised against此蛋白的胞外域，而两个多抗是against胞内域。但是不
清楚为什么单抗就检测不出full length的蛋白（现在想可能因为mAb无法识别full
length的conformation？大家觉得这个猜测对吗？）
现在开始做in vitro的细胞培养， |
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J********3
发帖数: 3151 | 3 Clontech 的GFP抗体很好用，用过Stem cell公司的nestin的单抗，很好用。
mouse的抗体，用在mouse样品一样没问题哈。 |
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W*****b
发帖数: 85 | 4 推荐一个不成功不收钱的定制抗体的公司，abmart。成立了不到5年的一个中国公司，
现在希望拓
展在美国的抗体定制业务，宗旨是不成功不收款，而且价格对比Sigma等大公司有绝对
优势。详细
情况可以到www.ab-mart.com了解，或者联系本人n********[email protected]，非诚勿扰
，谢谢。 |
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F**********e
发帖数: 158 | 5 这个不是你的问题也不是抗体的问题， 本来在mouse colon tissue 里caspase－3 阳
性的细胞就很少的， 基本上很难看到
偶尔有一两个。 如果你用intestin tiusse 的话可能回多一些
但是也很少
这个抗体我也在用 1：200
就很好了 |
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V********n
发帖数: 305 | 6 其实一直有这个疑惑。做WB的时候会出现非特异性的带，但可以通过蛋白大小加以排除
。理论上FC的抗体也可能出现这样的情况。前几天FC和WB同时做了一个表面分子，相比
isotype对照，FC做出来有明显的表达。但WB无论如何也做不出条带（WB有阳性样品对
照，FC和WB的抗体不同）。 |
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t****p
发帖数: 1504 | 7 不知道本版有没有人有抗体纯化的经验。
血清过抗原柱，用PH2.5的Glycine洗脱，最浓的几管fraction沉淀出来了（管子有加1M
Tris buffer），形成浑浊液，无法重新溶解 （调PH，加盐都无效）。
溶解问题不解决没办法dialysis，抗体放4度时间长了估计也有问题。哪位知道trick赶
快指点一下，包子相谢！ |
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n******e
发帖数: 110 | 8 沉淀的不一定全是你要的抗体。测一下剩下溶液里抗体滴度先。要是还是很高的话，就
直接透析溶液，沉淀以后再说。不过我推荐用脱盐柱来换buffer，又快又好。
1M |
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l*****r
发帖数: 131 | 9 楼上说得对，关键看你的抗体是不是在可溶部分。如果沉淀的是你的抗体，不妨试试2M
Arginin pH4.3，我试过洗脱效果比pH2.5要差点，但还行。另外还有个idea，如果BSA
在Glycine里不沉淀的话，加点BSA试试。如果这个办法可以能给我发个消息吗？祝好运。 |
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f******s
发帖数: 440 | 10 遇到过和LZ一样的问题
4个抗体，2个没问题，2个有沉淀，完全一样的操作。
沉淀后的上清部分抗体量很低，可以估计大部分在沉淀。
透析之后情况没有好转。无奈，全部过滤掉了......
希望LZ找到更好方法。
1M |
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M*******h
发帖数: 294 | 11 我有一个his tag的蛋白A，和从rabbit血清里纯化出来的抗体B（我用protein A
agarose纯化
的，应该是各种不同IgG的mix吧。。。），想用affinity purification来得到对A比较
specific
的抗体。我能大概想出来的流程是：把A挂到Ni柱上，然后把B通过柱子，再然后把B从
柱子上洗下
来，但是不知道具体应该怎么操作（从来没做过蛋白，真是惭愧）。想请教版上大牛们
有没有具
体的protocol可以参考。万分感谢！ |
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E*C
发帖数: 1629 | 12 我自己画了个图，不知道能不能看清楚。
抗体XX是针对蛋白片断AD得到的。ELISA检测XX和AD结合值很高。
把这段蛋白重组成2个片段AC，BD （中间有重复片段BC）。 ELISA检测XX和这2个片段
都有结合。
把这段蛋白重组成3个片断AC，BC，CD，ELISA检测，XX和他们都不结合。
现在问题是：
1， 怎么找到最可能的抗体表位？
2， 怎么解释XX和3个片段都不结合？
各位大人请赐教 |
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s******n
发帖数: 63 | 13 噢，谢谢。
可是这个抗体从来没出现过非特异啊........ |
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v******n
发帖数: 257 | 14 版上有没有人用过ＳＵＭＯ的抗体啊，ｓｕｍｏ１，２，３的都行
我想测试一个蛋白在特定的情况下有没有被ｓｕｍｏｙｌａｔｅ，打算把这个蛋白给IP
下来然后做个ＳＵＭＯ的ｂｌｏｔ
目前买了２个公司的抗体，什么条带都看不到的说
有没有给推荐的呢？ |
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s*********e
发帖数: 100 | 15 最近一直在用BD的mouse-anti-mouse的eNOS抗体，效果特别差。
有没有做过小鼠脑组织eNOS染色的xdjm，推荐一个好的eNOS抗体？
非常感谢 |
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s********e
发帖数: 33 | 16 我们研究的X由于没有好的抗体一直不能做染色，所以做了一个把X和GFP融合在一起表
达的老鼠，这样
通过GFP来显示我们研究的X的表达部位。
请做过小鼠GFP组织染色的xdjm推荐一款好用的GFP抗体。
谢谢 |
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h*****o
发帖数: 342 | 17 用过invitrogen的GFP抗体，不错
不过一般来说不用抗体也能看到绿色吧 |
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m****M
发帖数: 360 | 18 有哪位做过抗体和DNA conjugate的？crosslinker是什么？最多能连多长的DNA/oligo/
primer （i.e.双链,单链都可以）。连后是怎么分离没有连上的DNA，要保持抗体仍然
具有结合抗原的能力。非常感谢 |
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o**i
发帖数: 1165 | 19 想要看solid tumor 里面血液细胞的多少
老板让我去看看有没有可能拿flow用的cd45的抗体去然IHC或者IF
我手上的抗体都没说能在IHC上work
请问大家有人做过类似的试验么? |
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f*****n
发帖数: 12752 | 20 cho细胞里表达抗体会糖基化，请问有什么技术可以分离同一抗体的糖基化程度不同的
组分呢？最好之后能再分析各组分比例。如果糖基化程度不高，像sds-page及size
exclusion 层析之类的可能分不开吧？
多谢各位指点！！！ |
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T*********y
发帖数: 643 | 21 正研究的一个蛋白有1500多个氨基酸，实验室一个博后原来合成10几个氨基酸的多肽打
兔子，没有得到好的抗体。因为我们希望得到很好的抗体做immunostaining,所以对抗
体的要求比较高。我现在打算从中选取个200-300aa长的两个片段，分别克隆到表达载
体中，然后细菌中表达纯化蛋白，然后送给公司制备两个多抗。我现在的问题是，如何
选取适合的蛋白片段？我所知道的是：1）选取的片段尽量不要含有非常保守的结构域
；2）选取的片段亲水性高，暴露在蛋白的表面。请问还有哪些其它因素需要考虑的？
另外有没有免费好用的软件可以预测抗原决定簇（epitope）？有这方面经验的朋友出
来指导一下，谢谢。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 22 都是这么说，不过我做过一些抗体的经验是，割胶出来免疫的抗体一般很脏，
最好的还是溶解在buffer里面的抗原。加tag的经验是gst虽然比较大，但是
效果最好。片段设计直接去问打兔子的公司，他们比较有经验 |
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j****x
发帖数: 1704 | 23 一般公司都可以提供rational antigen design的服务，从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的，
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高，一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息，
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右，一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务，这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择，以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫，取决于你要做什么样的staining了，要求抗体特异性好的，就不建议这么
做了，光做western的话还凑合。 |
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f*******o
发帖数: 164 | 24 哦，就是有些杂质产生一些杂抗体是关系不大的，将来再重新提纯抗体就是了。非常感
谢！ |
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c*****i
发帖数: 1392 | 25 不溶的蛋白是可以，不过也要注意产生抗体针对天然蛋白亲和力低的问题（尤其体内实
验），即使是亲和纯化得到的特异性抗体 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 26 你要是还试新的抗体的话可以去上边找找看有没有中意的。
我近期有点新突破，准备多试几个抗体玩玩儿。^_^ |
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m*******n
发帖数: 387 | 27 推测某个非histone的蛋白可能被甲基化
想用pan-methylation-K的抗体试试，当然是IP之后
求推荐一个比较好用的抗体
或者还有其他比较好的方法，证明某个蛋白可以被甲基化吗？ |
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l********g
发帖数: 400 | 28 mouse 的 p53 抗体很多, 不知哪个公司的效果最好. 请知道的推荐一个好抗体.
谢谢. |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 因为懒和穷，所以以前都是用anti-PAN cadherin 抗体（可以和大部分cadherin
反应）。一直没有用过专门的N-cadherin 抗体。现在不得不用了，但是不知道
哪个好用哪个不好用。 |
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s********n
发帖数: 342 | 30 记得网上有人说过从中国买抗体在这边用，所以从这边买抗体寄给国内应该也是没有问
题的吧。
请同学们confirm一下，谢谢！ |
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C**S
发帖数: 522 | 31 室温不行吗？我们买的很多抗体都是室温寄过来的，比如santa cruz的。抗体很稳定吧？ |
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x*****e
发帖数: 309 | 32 一些高保守蛋白的抗体制备好像有些技巧，我以前老板就用自身免疫病的小鼠做些高保
守蛋白的抗体，还有在抗原上加些tag什么的。
的。 |
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p********e
发帖数: 61 | 33 没错。一些敲除了对Negative Selection比较重要的分子的老鼠甚至会对自身蛋白产生
反应，对高保守蛋白更不在话下。但这些老鼠生存能力都差，养起来较贵。实验室做实
验可以，对于抗体定制公司来说不划算，没有一家用基因敲除老鼠来做抗体的。 |
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x*****e
发帖数: 309 | 34 一些高保守蛋白的抗体制备好像有些技巧，我以前老板就用自身免疫病的小鼠做些高保
守蛋白的抗体，还有在抗原上加些tag什么的。
的。 |
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p********e
发帖数: 61 | 35 没错。一些敲除了对Negative Selection比较重要的分子的老鼠甚至会对自身蛋白产生
反应，对高保守蛋白更不在话下。但这些老鼠生存能力都差，养起来较贵。实验室做实
验可以，对于抗体定制公司来说不划算，没有一家用基因敲除老鼠来做抗体的。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 36 最近刚用这个抗体做过，效果还不错。
santa 的抗体只要封闭的时间足够长（5% 的牛奶室温摇床3小时）
，目的条带还是很清晰的 |
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h****k
发帖数: 182 | 37 这个抗体和做western, elisa的抗体比较有什么特别的吗？ |
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c********b
发帖数: 363 | 38 有经验的gxdm请推荐一下比较可靠，价廉物美的抗体制备公司，最好是直接给peptide
sequence然后4-6个月后就可以有抗体的那种service。
多谢！！ |
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c********b
发帖数: 363 | 39 先谢谢楼上各位。不知道有没有人用过sigma的service。我对genscript的peptide
service没有信心，买过一次，提高了100X的浓度还看不到多个实验室反复报道的现象。
我已经做了一个Ab，用的cocalico的service，象你提到的那样。能用来做WB，IP就很
难了。
然后发现我做的蛋白有alternative splicing，做的抗体能识别两个form，现在发现第
三个form也不能忽略，所以想再做一个抗体。还以为用peptide的特异性会高一些呢。
是不是自己表达一个50aa的peptide效果更好？
再次感谢！ |
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S******9
发帖数: 2837 | 40 最近做GFP和MAP2的double stainning。因为都是rabbit来源的，所以先做的GFP的
staining，然后做MAP2的staining， 总是做不出来， MAP2 抗体来源是cell signal。
今天做HA和MAP2， HA和GFAP的双染， 后者不错，前者出不来MAP2
所以请教大家MAP2有没有好的抗体推荐? 做脑组织染色用的。
谢谢 |
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h****n
发帖数: 2552 | 41 抗体很稳定的，一般不会有问题。反复冻融的抗体除外 |
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k******0
发帖数: 1073 | 42 如何长期保存抗体，还真没有好办法。
我的同事都是一部分4C，一部分－20C，还有一部分－80C。不同的抗体适合不同的温度
，需要自己摸索。通常－20C和－80C的好些，
但如果溶液体积小，如20uL，过几个月可能就干掉了。你加甘油的倒是个好办法，我以
后也试试。 |
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p******b
发帖数: 379 | 43 搭车问个问题，
现在想构建一个质粒， 在不同promoter下面分别表达两个荧光蛋白， 然后做
transgenic 老鼠，需要考虑组织自发荧光， 并且可能需要用抗体做染色之类的， 所
以需要目前市面上有好抗体的荧光蛋白， 请问选什么荧光比较好？ eGFP和mCherry可
以吗？
THANKS |
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p******b
发帖数: 379 | 44 搭车问个问题，
现在想构建一个质粒， 在不同promoter下面分别表达两个荧光蛋白， 然后做
transgenic 老鼠，需要考虑组织自发荧光， 并且可能需要用抗体做染色之类的， 所
以需要目前市面上有好抗体的荧光蛋白， 请问选什么荧光比较好？ eGFP和mCherry可
以吗？
THANKS |
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b***s
发帖数: 14 | 45 刚看了新星 Zhimin Lu 的两篇CNS paper
Yang W, Xia Y, Hawke D, Li X, Liang J, Aldape K, Hunter T, Yung WK, and Lu Z
PKM2 phosphorylates histone H3 and promotes gene transcription and
tumorigenesis. Cell 150(4):685-696,
发现几个感兴趣的重要在抗体都从 http://swbio.com/
Signalway Biotechnology 买的，从没听说过这个公司，google一下，发现Signalway
Biotechnology LLC has a location in Pearland, TX. Active officers include
Zhimin Lu and Ji Wang.
有人用过他们的抗体吗，想买试一下，谢谢。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 46 兔子的抗体基本都要两个月或以上吧
我在公司做过好几个抗体，都是要两个月左右 |
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s*****a
发帖数: 59 | 47 蛋白N端2xHA tag。以前看到这里有人推荐Roche 3F10的HA抗体就买来试试。用来做
Western blot很好，可用来做HEK293和neuro2A的immunofluorescence信号和背景都不
好。我的条件是，methanol fix, 一抗是HA (3F10, 1:500) 4 度overnight, 二抗是
Alexor Fluor 594 goat-anti-rat。请问哪里需要改进？有没有更好的HA抗体和染色条
件推荐？ |
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s****9
发帖数: 932 | 48 抗体和抗体差异很大，大多数可以。Fix完之后要permealize一下会有很大帮助 |
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m*******r
发帖数: 202 | 49 老板让作一个用新的单克隆抗体治疗带肿瘤裸鼠的报告。以前没有做过这方面的工作，
这段时间读了很多文献，学习了很多东西，发现做这方面还是很有意思的，比我以前做
的基础的东西有意义多了。
现在热情很大，但不明白的问题也很多。向大家请教一个问题：在这种用新单克隆抗体
治疗带瘤裸鼠中最常见的问题是什么？
小妹先谢过了。 |
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m*******r
发帖数: 202 | 50 非常感谢你的回复！！！我是学分子生物学的。
我就是打算将在BALB/c小鼠制备的单克隆抗体再腹腔注射到带肿瘤的BALB/c裸鼠中，观
察该抗体是否有抑制肿瘤生长的作用。老板让我写一下在这种实验过程中可能会遇到的
问题，以及可能的其他选择方案。有些象他写grant中的potential pitfalls and
alternatives。
对我一个在这个领域的新手来说，实在不知道在这种实验过程中可能会遇到什么问题以
及可能的选择方案。请多多指教。再次感谢。 |
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