j**W
发帖数: 89 | 1 希望直接从knock-in mouse看engineered sites.试了PCR followed by gel
purification of the correct-sized band and sequencing.每次都只能读到某区段就
读不下去了.有人知道是怎么回事吗? 愁死了.谢谢! |
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j**W
发帖数: 89 | 2 受教了。多谢！还有一个问题：两次PCR都不切right-size bands,不会有很多很多wild
type allele被放大从而影响sequencing吗？ |
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q***7
发帖数: 144 | 3 看来你不但好多东西没有说，而且表达还真是有问题。你的中文真的很难理解，尤其是
上面的解释。还不如英文清楚，虽然英文也有很多错误。
你说RESULTING SEQUENCE包括。。。。（我们一般从测序引物的那边说起，你这却从离
引物最远的那边说起）说明序列都测过过那个LOXP区域了。但是你中文里又说P２之后
７０BP就停了。
你不是搞分子生物学出身的吧？用P２做引物测序后面都是DOWNSTREAM，应该说P２后７
０BP。这targeting vector也不是你构建的吧？知道为什么要扩那么长吗？你如果能回
答出这个问题 说明你还懂些分子生物学。
你这图比例严重失调，GFP６００BP左右，你EXON１５００BP左右，图中差别却是几倍
。还有，你P３应该在GFP后面离EXON１１００BP左右的地方，你却标到了GFP的中间。
好啦，现在回到你的问题。你不应该用P２来当测序引物，离你需要确定序列的地方太
近。
最早测序时，测序引物后面５０BP左右（甚至到１００BP以上）的序列是读不出来的。
所以那时的测序引物一般设计在需要确定序列的上游至少５０BP以上。大多数引物都
设计在要确定的序列上游１０... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 4 正常的PCR错配比例很低而且每个碱基的几率是一样的，所以错配的只是测序里面的背
景噪音，对测序结果没有任何影响。只有在需要单个分子的时候，比如做分子克隆或者
做nested PCR时，才要考虑到单个的分子可能有突变。nested PCR解决这个问题的方法
就是不要大量稀释，而是降低循环数（提高模版来源于不同PCR产物的数量，同时降低
了PCR反应的次数所以也减少了错配的次数）
sequence
region
NotI
吗, |
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s******r
发帖数: 1245 | 5 他的意思是他们在exon和intron中间插了个loxP，但是sequence出来的exon后面直接就
是intron，那个loxP不见了，看上去就和wt一样。扩4k很正常，保险点的PCR一般是要
flank homo arm的看当时es怎么做的了，当然southern啥的都做了，扩短一点可能问题
也不大。
建议楼主仔细查查这个knockin当时是怎么做的，那个位置是不是应该有这个loxP，这
个设计图看着很奇怪，是不是漏了点啥或者有地方画错了。另外可以用P1测一下看看能
不能测到GFP cassette，这个长度测序末尾应该能测到外源序列的，那就确信测得是
targeted allele了 |
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p****e
发帖数: 105 | 6 SIV mac251 p27 protein sequence，有没有数据库？多谢！ |
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f********n
发帖数: 20 | 7 I was wondering if there is FLAG sequence (DYKDDDDK) in any nature protein.
Any body knows? |
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l******u
发帖数: 936 | 8 RT 实验影响转录水平的研究不仅仅在RNA Seq 中存在， 普通表达谱microArray中也有
，最好的方法是直接读RNA测序，还有的就是现在做转录的很好的工具 nanostring，
但是nanostring 不能做到 de novo sequencing 的很多东西。
trans
is |
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S*********e
发帖数: 127 | 13 just get the whole exome sequencing results. need help for followup analysis
on mutation/snp etc.
any suggestions? |
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y**q
发帖数: 570 | 14 根据项目需要，要设计突变基因的 primer；本人在primer design方面纯属外行，请教
，如果知道基因的突变点，到哪个相关网站可以search到这个突变基因的sequence？
有什么好的建议，请指教！ 多谢了！ |
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c***x
发帖数: 1169 | 15 小弟第一次做RNA-sequencing。3对（WT vs. Mut)6个样品的coverage distribution如
附件所
示。core facility说样品WT3和MUT3还成，但是其他4个好像比较差。
麻烦大牛指点一下后续的data能否使用，或者还有啥需要注意的。多谢多谢。 |
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m***T
发帖数: 11058 | 16 首先你得解释清楚你做RNA-Seq的目的是什么？一个样本需要多少reads？这些样本之间
是什么关系？
另外，core lab给的qc明显不够，有没有BioA的traces（包括RNA本身及library制成后
的），定量用的也是BioA还是qPCR等其它手段？Barcode就是如果一个样品所需要的能
量小，那一个run可以用加barcode的方式来区别不同样本，这样可以把多个样本pool在
一起做sequencing，成本会降低很多。
另外是在什么平台上做的？Illumina的还是其它的？ |
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m********2
发帖数: 317 | 17 用lenti viral vector做了个shRNA screen，测序已经做完了，现在需要个软件分析，
其实应该很简单，就是看每个shRNA的读数。
老板联系了一个生物信息组，他们说至少需要６个月，
请问大家有没有什么免费的软件能够分析deep sequence结果
万分感激 |
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s***f
发帖数: 23 | 18 不能光看sequence, mRNA是形成结构的。 |
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l******a
发帖数: 3339 | 19 不能用cmv protomoter 来sequence？
But
? |
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h*********g
发帖数: 18 | 20 Next I will use restriction enzyme to cut, and use T7 and SP6 to make probes
. So I want to know the correct sequence. Why sp6, M13forward and reverse
not working? Thanks.
But
? |
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f*****f
发帖数: 195 | 21 买的载体总会有序列，公司的通用引物也该有序列吧。比对一下看看具体在哪有没问题。
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是指sequence of insertion还是完全没信号，假如引物跟载体能匹配的话估计就是测
序的问题了，想测哪段自己合成引物也成。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 22 准备开始做RNA sequencing .从小鼠的incisor里面提取细胞，一个incisor能sort出大
概600个细胞。计划用30只小鼠，每个小鼠取俩下颌incisor, sort出大概3万个target
细胞。
按有些信息来源说大概从30K细胞能抽出来 0.5 ug的 RNA
问：
够不。
要是不够有啥别的办法做。扩增靠谱不。
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我的摄影作品网站
www.oxygenfoto.com |
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z****u
发帖数: 1007 | 23 关于是否sample 混杂. 我的理解是，因为我在寻找一个在这个population里高表达的
gene, 希望在不同的老鼠里都同样的高表达，所以把很多sample pool together应该有
好处。500个cell/mouse实在太少了 。
我们的core说mRNA量在20ng以上，按照mRNA占总RNA 5%左右的比例计算，预测需要1ug
的总RNA.
对single cell sequencing或者RNA amplification 实在有些没信心，能推荐个啥公司
做这玩意的吗。我们的core 反正做不了。 |
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r******g
发帖数: 600 | 24 没有kozak sequence, 但是有ATG。
蛋白能被表达吗？ |
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r******g
发帖数: 600 | 25 我做的human cell line～ 我老板跟我说，不需要kozak sequence一样可以表达？ 我
都有点儿不相信... |
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i*******i
发帖数: 145 | 26 除了pacbio，没有一家的sequencing能在理论上达到perfect assembly。
pacbio只要有足够的coverage （现在很多大lab有钱，能达到100x以上的coverage），
是可以做perfect assembly的。所以做science的未来是pacbio的。
oxford有pacbio的优点，而且比illumina还要便宜。他们的问题并不是accuracy差，是
不stable。但是我相信这些都是engineering的问题。最终都会解决的。所以future是
oxford的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 27
你这个毫无意义，技术上很美不等于应用上美。用最土的sanger sequencing
也能比illumina做de novo上强，没通量有人用么！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 28 LIFE家大业大，sequencing在它家也就占一小部分，并入TMO后就更是九牛一毛了，因
为看好solid或者ion投资LIFE/TMO，简直是瞎猫碰死耗子
新技术没出来前就是ILMN最牛逼，反正也没什么其他可买的，要不你等华大上市吧 |
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j******i
发帖数: 939 | 29 t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序，然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的，不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱，任性！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 30 deep sequencing适合做量大的，几个sample的做划不来，多到几十上百个sample的话
比其他方法都便宜 |
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h*******u
发帖数: 126 | 31 大家好！准备和一牛人干，以发论文为目标。请问，如果以猪作为实验动物，怎么做
sequencing 才可以发高水平的论文呢？ 用CHIP-seq或者其他技术都可以。大家有没有
好一些的思路。
谢谢！ |
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f*****f
发帖数: 195 | 32 看哪些shRNA/guide RNA被富集，deep sequencing depth一般不需要RNA-seq那么高吧
，一个样品一般价格多少？有公司测序链接么？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 33 大谢！
不记得lentivirus的vector会整合到genome呀。他那个GeCKO v2 vector（包含guide
sequence和Cas9)也能整合进genome吗？
我们有一个自己筛出来的compound，还有一个新的pathway, 所以，想借他的这个思路
，找出这个pathway上的其他蛋白分子。这个思路很不错。
谢谢这里的大侠们。上次来问CRISPR技术,倒是真用这里大侠们提供的方法和思路，作
出了single amino acid的突变（还有几个Nt的突变，引入酶切位点和搞掉PAM，但不改
变amino acid)，连两个拷贝都replace的克隆也拿到很多。这里还真酸生物同行的家。
：）。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 大概你的ES长得快。我建一个，至少得一个多月呢。筛选也得两个礼拜到三个礼拜，然
后characterization。上几个月帮一个学生建，他那个细胞长得太慢，doubling time
是两天，结果花了三个月才拿到stable cell lines。
我知道你说的那篇Nature Biotechlogy文章，是老鼠的。也在研究那篇文章。就是这个
sequence部分不太懂。哎，作研究，年龄是大了点，没跟上bioinformatics这些新东西
，越看越糊涂。
谢谢！有问题还会上来找你和其他同行。Have a nice evening!
cas9 |
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y****m
发帖数: 37 | 35 in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of gRNA
integrated as some integrated gRNA virus won't express at all, which are
common false positives in any genome-wide screens. |
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O**********a
发帖数: 317 | 36 不表达的就不会work，也不会被筛选富集啊
[在 yyadam (sunwind) 的大作中提到：]
：in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of
gRNA integrated as some integrated gRNA virus won't express at all,
which are
：common false positives in any genome-wide screens.
：........... |
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m*********D
发帖数: 1727 | 37 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心：如果CRISPR
function很快，virus进细胞后表达gRNA/Cas9，马上ko了一个pathway上的基因，3天的
puromycin selection期间，没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以，我以
为sequencing整个genome来找呢。
既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
的signal transduction的“网络”已经很成熟了，找到几个估计就会有谱了。看了
Feng zhang的method section,细胞用量很大，估计是不是考虑了整合进genome的效率
不是很高这个因素。
我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor，
所以，就想自己试试。
谢谢！
gRNA |
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m*********D
发帖数: 1727 | 38 严格地说，我不知道“不整合又有功能的几率”。你的ES可能integration的概率高一
些，我以前作过knockout老鼠的stem cell。平常用cnacer cell line作stable,反正拿
到的效率很低。除了transfection的效率低，integration的概率低可能也是原因。
他那个300X的library coverage,不知道是不是考虑到这个因素，我的理解是每个guide
RNA有300个机会（转进细胞），加上一个gene有三个guide sequences,就是每个基因
平均有900的机会，这样也许能compensate integration的概率低？我的瞎理解。
100M的细胞，大约是10个T75 flask,我应该能对付。：）。 |
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n******7
发帖数: 12463 | 39 难得看到一个有诚意的postdoc贴
顶一下
1. 这个研究方向我很看好。
一来，能lead大型sequencing project的话，基本可以保证发非常decent的paper了，
最不济也能作为resource发了。我参与过几个这样的project，对有机会lead的哥们儿
是羡慕嫉妒恨。
二来，cancer genomics是很有应用价值的，特别是现在讲究personalized medicine，
癌症治疗首当其冲。这对以后个人发展，不管是当PI还是进公司都不错
三来，做clonal evolution这块对统计算法要求挺高，对个人能力是个不错的提升，比
单纯跑pipeline能学到的多。
2. 楼主显得很有诚意。
以前我在SD版曾因为UCSD的签证政策跟两个ID吵架，因为他们根据自己的经历，坚信
UCSD不sponsor H1B。而我很多朋友就是H1B的postdoc，其中有个lab是你自己选，每天
做我旁边写code的哥们儿也是H1B。这两ID就是不信，只能呵呵了。
但是，我很多NIH postdoc的朋友，从来没听说过拿NIH H1B的。楼主提到这个，我觉得
为人应该不... 阅读全帖 |
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n******7
发帖数: 12463 | 40 你不是还在学校混吗
弄点自己的sample去sequencing core测一下就好了
这些个商业公司我觉得都是居心叵测 |
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e*******o
发帖数: 4654 | 41 实验室自己的机器 那些postdoc肯定不愿意给我忙活啊
我看看学校有没有 sequence core |
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b********w
发帖数: 334 | 42 我们Genos 很靠谱
$399 CLIA-certified 75x whole exome sequencing
Beta 期间你要原始数据，我们也可以提供。
私信我 |
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b********w
发帖数: 334 | 43 下周有去ASHG的吗？
来Genos的booth 432. 每天下午3：30PM有抽奖， free personal exome sequencing。
而且ASHG有一个特别的discount. 走过路过不要错过 |
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n******7
发帖数: 12463 | 44 你不是还在学校混吗
弄点自己的sample去sequencing core测一下就好了
这些个商业公司我觉得都是居心叵测 |
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e*******o
发帖数: 4654 | 45 实验室自己的机器 那些postdoc肯定不愿意给我忙活啊
我看看学校有没有 sequence core |
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b********w
发帖数: 334 | 46 我们Genos 很靠谱
$399 CLIA-certified 75x whole exome sequencing
Beta 期间你要原始数据，我们也可以提供。
私信我 |
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b********w
发帖数: 334 | 47 下周有去ASHG的吗？
来Genos的booth 432. 每天下午3：30PM有抽奖， free personal exome sequencing。
而且ASHG有一个特别的discount. 走过路过不要错过 |
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B***v
发帖数: 113 | 48 老板交代的任务。寻找cDNA的序列NCBI gene就可以吧？
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
我的感觉是很多不完整的序列在里面，鱼龙混杂，对一个不熟悉的基因很难分辨哪个序
列是对的。还有其他的更可靠的数据库查询cDNA序列吗？我只要找到不同物种的ORF即
可。
sequence alignment哪个软件比较好？或者是基于web的。最好是免费的，基本可以肯
定老板不会同意花钱买的。 |
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发帖数: 1 | 49 sequence alignment的话MEGA就可以做，fasta输入。 |
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s*********y
发帖数: 292 | 50 你如果样品少，可以把PCR产物克隆到T载体（或者任何载体）上，然后挑几十个克隆去
测序。这是可以接受的笨方法，至少，bisulfate sequencing之类的东西一直都是这么
做的
当然，只适合少量样品 |
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