Z******5
发帖数: 435 | 1 我之所以问这个问题，是看了一些kit的protocol，上面都是说最后加模板，所以比较
困惑。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
这个选项。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 3 比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。 要看基因G的变化，就是看它
在实验组和对照组中相对于内参的变化。 这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
定量吧。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 份特。你这个明显用一个很简单的相对定量qPCR就可以搞定。
应该就是不同的模板！因为处理和没有处理的细胞的模板是分开的！
绝对不可以混到一起来！否则就没法作了！ |
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Z******5
发帖数: 435 | 5 我也分特了，我的意思是比如定对照组中基因G和GAPDH的量时，应该先把模板，mix之
类的加到一起，最后分装之后再加引物。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 6 可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
两个样品--实验组&对照组， 两对引物--目的基因和内参， 假设每个只做一管，不用
做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
1，分别加一个2x的 实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和 对照组cDNA，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
2，分别加一个2x的 目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和 内参引物，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 7 I mean in 3-replicate wells, the last thing is addition of primer. |
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y***k
发帖数: 60 | 8 理论上确实1更好一点，可以减少不同管中cDNA量差异带来的误差
不过碰到大量sample的情况还是2更方便啊......并且我不觉得2会比1差很多......
，
， |
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？ |
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Z**********g
发帖数: 222 | 10 都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事. |
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c******r
发帖数: 3778 | 11 同学，你这个连term都乱用啊
模板是说template，就是你的cDNA。
你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
别。
因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 我就是这个意思啊
所以lz的意思没看懂
想让人指点一下 |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
这个实验应该这么做：
1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
所以要跑两次PCR. |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 可是他明显不是那个意思啊，他是想把template 先加上去，然后再加不同的
primer. 所以他这个不是为了做3-replicate |
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c******r
发帖数: 3778 | 16 应该可以做multiplex reaction
GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
确定的同一个loading量。
另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么
triplicate之后会得到三个G的量，和三个GAPDH的量，而这六个量之间没有一一对应的
关系。就是说不能用G1/GAPDH1，G2/GAPDH2。。。。而只能用G的平均值/GAPDH的平均
值。但是... 阅读全帖 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 17 sun姐可能误解了LZ的意思了，LZ是说对于同一模板（比如control的cDNA）,假设要扩3
个基因，又假设每个基因3个replica，就是9管，这样先配9倍体积的1X mix,包括
Mastermix,dye,H2O,cDNA,然后分装成9管，每三管分别加入1个基因的primer；同样对
treated的cDNA也一样。
然后有人说这样就产生了由引物带来的系统误差。我的问题是如果最后加入模板，由
pipeting所产生的误差叫什么误差？如果由引物带来的系统误差都足够大到不能忽略的
话，那么可以想象，由最后一步加入模板所产生的这种误差会大到何等程度。这样反而
最后加引物更为准确了。
不过如果最后加引物，对于同一模板同一扩增基因的replica而言，似乎就没什么意思
了，感觉这种replica目的是要测由所加引物所带来的差别。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 18 大家都过虑了。
模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
（有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
，这样都可以容忍。
你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太
多。简便起见，我只说说引物和master mix（就是buffer，原料、酶、荧光染料的混合
物）。在对数扩增曲线（LOG VIEW）中，模板的多少主要影响x轴截距；引物的多少主
要影响平台的高度；master mix的特性主要影响斜率（... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 对于院长的这句话我不敢苟同
“只能用G的平均值/GAPDH的平均值。但是得到的这个平均值却没有standard
deviation”
如果照你这么说的
那还需要误差传递公式做什么 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 “realtime PCR是个非常敏感的实验”
我非常同意这一点
换句话说，这个实验有很大的系统误差
说实话，是属于你做得越多想得越多越不喜欢不觉得可信的一种实验！
40% |
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Z******5
发帖数: 435 | 21 假设两次加模板的量分别是X1和X2，得到的Ct值分别是Ct1和Ct2，
那么delta Ct= log（X1/X2，2）
假设加模板的误差是1%，简单点，就是你一管加了5ul，另一管加了4.95ul， 那么
delta Ct就是0.0145， 这个误差肯定是可以接受的；
但是假设加模板的误差是1/10，就是你一管加了5ul，另一管加了4.5ul，那么delta Ct
就是0.152，这个误差还是不算小，但也还算可以接受。
我想即使对于菜鸟而言，加模板的误差也不应该比1/10再大了，所以我还是收回我的问
题算了，不过很感谢各位的讨论。
我还是菜鸟，自己勤快一点，早算一算就好了。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 22 同意你这个说法，哈哈。 我就是要检测对照组和实验组中10几个基因的差别，所以就
先加模板了。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 23 菜鸟弱弱的问一下，one-step RT-PCR指的就是Two-Step Cycling？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 24 我设计引物的时候都会设计成同一个退火温度的。一次PCR搞定，这样比较方便呢。
separately, with 3 replica .
separately, with 3 replica |
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Z******5
发帖数: 435 | 25 "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
测的基因"
这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
的。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 26 讨论总是有益的。自己算，即使能得出准确数值，但是得不出集体讨论所覆盖的广泛外
延。
做RT-PCR，不用过分追求百分之几、十几、甚至几十的误差。因为cDNA存在百分之几百
、几千的差别（也就是数量级上有差别），才会有蛋白水平上detectable的差别，才会
有意义。
Ct |
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h********n
发帖数: 4079 | 29 在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
实没啥影响.
40% |
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j****x
发帖数: 1704 | 30 无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
30%，我猜想手工加之会更多吧
一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 顶一下这个。 我一般都至少用3ul
20-
响了 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 32 cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 33 听说那个384 well的就是用10ul的反应体系啊。 我只用过96 well的，一般都是20ul体
系。 |
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M****m
发帖数: 2142 | 34 我是引物相同的都先混在同一个1.5 ml管子里，其实也就是俩管子，一个是
housekeeping gene another one is the target gene，然后按模板在分出来，一般
technical control，就是同一个模板3个重复，96 well也就是32个小管，16 each for
the two genes，然后模板加3 ul，但是一般是做4份的量，因为分装第三个总会不够
，所以要多作出来一份。我是10 ul体系，所以就是做40 ul （36 ul master mix+4 ul
template），还有这样你模板不会只加1 ul，相对而言加的量更精确些。不知道说明
白没有。。。【 在 Zifeng85 (Zifeng85) 的大作中提到: 】 |
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M****m
发帖数: 2142 | 35 误差总是存在的，只要最后error bar不是很离谱我觉得都可以接受啊。
另外排枪觉得很不好用，有的时候有几个不能完全加进去，不过确实比一个一个加速度
快很多
扩3 |
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M****m
发帖数: 2142 | 36 他应该不是指同一管而是同一plate，96的话就是各48，不过我们这里一个老板说还要
做3个no template的，所以其实是各45 |
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M****m
发帖数: 2142 | 37 我一直作的10，结果也挺不错的啊，为什么说鸡贼？什么叫贪心，产出一样投入少挺好
的，实验室有钱无所谓钱不多就得较劲脑汁省钱。难道你是这些公司的？那么仇视。。
。。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 38 LC480系统上一直用20，后来新来的博后建议改成10，测试了一下效果也还能接受，就是
SD明显大了不少，尤其是实验员负责加样的结果，经常惨不忍睹。后来换成了机器人情况
就好多了。对自己的枪和手比较有信心的话，10ul体系确实没什么问题 |
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M****m
发帖数: 2142 | 39 赞有钱，还有机器人。。。SE我的还不错，可能如果差别不是特别明显的SE大了会影响
，但是差别大应该没什么问题吧
就是
情况 |
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t**a
发帖数: 255 | 40 knock down 后多久才死？一般infection 2-3 天后用qRT-PCR检测target gene表达量
，如果那时候细胞还活着的话。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 41 unlabeled RNA binds to different site on the protein (hence the sandwich),
and is measured w/ qRT-PCR for read out. However, my labeled aptamer
has the same primer. hence the 杯具。。。其实主要是一直就没想到biotinylated
RNA会fall off，troubleshoot了好久。。。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 42 网上模板的算法肯定不对。
但算法不对，不一定结果就不一致。
打个比方。两个数字求几何平均。如果用了错误的方法（比如算术平均、对数平均...
），不一定就和几何平均有太大偏差。关键看这几个数字差别有多大。差别越大，不同
算法的结果相差越大。
详细解释会很花篇幅，以后有机会慢慢讲。 |
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O*********e
发帖数: 79 | 43 多谢回复，看来我还是得老老实实用数学公式算算了
问题是这个不是网上随便找的模板，是SABiosience卖的SuperArray的数据分析模板。
它给的example里面那五个housekeeping genes的Ct值差别很大，从14.2到25。版上有
没有人用过SuperArray的？望指教:) |
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f*********r
发帖数: 1233 | 44 公司给的模板大多有概念性错误。我不知道他们是真的不懂，还是故意简化计算，从而
让顾客容易上手，容易接受他们的产品。我上面说了，算法错误，不一定得不到接近正
确的计算结果。但条件是你的曲线非常理想。 |
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k****o
发帖数: 589 | 45 呵呵，想起以前楼长给我解答的时候了。
Ct是幂指数，不能直接求算术平均的。应该是转化为模板的数量后再求算术平均。
不过只要你的样品duplicate或者triplicate的标准差不大，直接求算术平均出来的结
果也不会有质的区别。
个人对于qPCR的结果只相信平均1.5倍或以上的变化。在这个前提下，一般来说根据用两种方法算出的
结果，得到的判断都是一致的。
另外跑两个housekeeping个人觉得有点浪费试剂了。我觉得还是把扩增效率算得精确些
更有意义。 |
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O*********e
发帖数: 79 | 46 嗯，我好像也记得版上有人详细讲过怎么正确的算平均。多谢了！
跑两到三个housekeeping不是为了减小误差。我的实验常常要对细胞进行处理，有时候
处理时间是几天，第一次做的时候我就会多跑几个housekeeping，然后选其中最稳定的
一个或者几个来做internal control。当然如果实验都熟悉了，后面就不用跑好几个
housekeeping了。 |
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x****i
发帖数: 50 | 47 严格来讲有区别，但是很小。
真正区别大到不能忽略的程度，说明你的某个HKG被调控了，最好在两种算法中，都把
那个HKG去掉 |
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o*****a
发帖数: 2335 | 48 这个Ct到底该怎么理解？是仪器测量值还是数学里的幂指数？我见的一个qPCR统计方法
的论文就是直接平均Ct。对测量值取平均抵消掉系统波动，再代入理论公式求浓度没什
么问题啊。
用两种方法算出的 |
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d****t
发帖数: 139 | 49 yes, I used SABiosciences online software before. Of course, The Ct of
different HK genes varies big, but as long as it doesn't vary much between
samples for the same gene, it is a good internal control. It has 5 HK genes
on one plate, so you can choose the good ones as your control. |
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d****t
发帖数: 139 | 50 I remember it has been standardized that 3 housekeeping genes are required
for publication. Will give you the link tomorrow if i don't forget.
用两种方法算出的 |
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