w*******y
发帖数: 60932 | 1 I received an email with an awesome price for Puros Indios SDO Cigars from
Cigars International. Most people that enjoy cigars know the great quality
and taste of Rolando Reyes' cigars.
Here is CI's description:
"This weekend, we shine the ethereal CI Spotlight upon the fruits of a
storied Honduran operation - Rolando Reyes's Puros Indios factory. 4-year
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15 per mazo of 20. An epic blowout, while supplies last.
In ear... 阅读全帖 |
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y******y
发帖数: 107 | 2 手头上有一个 pBABE-puro SV40 LT plasmid ，是从addgene买的， 图谱如下连接
http://www.addgene.org/13970
请问一下这个plamid能否表达 SV40 large T antigen( LT). 因为从图谱上看是 SV40
LT gene是插在BamH I位点之间，可是这个SV40 LT gene是在SV40 promoter 之前，另
外一个比较奇怪的问题是为什么有两个SV40 promoter，多谢！ |
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q*****n
发帖数: 331 | 3 My personal experience:
neo and puro are good, quick selection.
Hygro is OK, but kill cells slowly.
Zeo is the worst, even zeo resistant cells have funny shapes. After a few
days of selection, you have to trypsinize cells off the plates and replated
cells without zeocin. Only zeo resistant cells will survive and grow. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 4 非常感谢。我准备用两个lentivirus质粒转两个基因，so neo and puro. |
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z******5
发帖数: 30 | 5 总是问很弱智的问题，希望各位大牛包涵。
pLVX-puro可以用psPAX2和pMD2.G包装吗？ |
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J****n
发帖数: 156 | 6 在下做植物的，猜想T2A puro应该是个promoter吧？谢谢解惑。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 7 可能会
对于2A前面的蛋白，如果C terminal序列有功能的话，还是用 IRES吧
对于2A后面的蛋白，一般就是Puro或fluoresence protein，关系不大。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 8 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
后重复好几回了，都是一样的结果，现在无奈把这一块交给公司做了，但是自己还是不
死心，今天写出来问问大家... 阅读全帖 |
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E*********4
发帖数: 16 | 9 我把一个蛋白的基因插在本来是shRNA的位点（AgeI site），做了transient
overexpression，可以做puromycin筛选，检测到蛋白表达，但是做了virus之后，加
puromycin，细胞全死了，说明puromycin没有表达。这是为什么呢？BTW，在我的基因
前加或者不加promoter，会有什么影响吗？
这是Tet-pLKO-puro的链接：
https://www.addgene.org/21915/
非常感谢！ |
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r***e
发帖数: 2539 | 10 看了下cell cycle 2009 原文，这个系统用的inducible H1 promoter,应该属于PolIII
，不能转录蛋白基因。你瞬转检测到表达，有可能是从lenti vector的external promo
ter转录的（我猜）。包装病毒后没有这个promoter了，所以没表达。
但是你说puro都不表达了，那可能是你病毒都没包装成功。
建议换载体。 |
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J**l
发帖数: 493 | 11 一次次的跌跟斗，看来教训还是没够
前段时间做个实验需要某cell line，刚好实验室一个senior postdoc有，他也正在用
它做实验，于是跟他要了些，同时跟他简单讲了我需要用这个细胞做哪些实验，他听了
以后没有任何comments。
我拿到细胞以后用载体引入了一些表达constructs（都有GFP tag），然后花了很长时
间做出了几个stable cell lines；接下来，我打算用lentivirus来转染表达shRNA的载
体，这就需要drug selection（puromycin）来杀死未转染的细胞来实现得到stable
cell的目的。于是我就做了个kill curve，然后就很悲惨的发现这个细胞怎么杀都不死
。。当然这话夸张了，事实上是我需要正常用量10倍的药量才能杀死大部分的细胞。我
只好发信问这个给我细胞的postdoc，结果人家轻飘飘的回了一句话：Yes, the cells
I gave you are puro resistant. 我看了这话真是出离愤怒！我当初跟他讲过我以后
会用到puro selection，他听了没反应；而且，我觉得这是co... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 12 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
*... 阅读全帖 |
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h*********y
发帖数: 360 | 13 有个智齿困扰我已久，前两天拍了x-ray，医生说下面两颗智齿长的位置很难拔，离
nerve非常近，可能不小心就会碰到。他说要用一种叫bone graphic的技术，就是用一
种叫puros的东西填进我的bone里面来拔智齿。
我看望上说这种叫puros的东西其实是别人donate的牙齿后弄成得粉。我从来没听说过
这些名词。请问有没有内行的同胞懂得bone graphic的？做这个surgery有没有危险？
价钱大概要多少？另外，既然puros是别人donate的牙齿,有没有可能感染HIV或者其他
的病？
非常非常感谢！ |
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h****a
发帖数: 65 | 14 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的g... 阅读全帖 |
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D***a
发帖数: 516 | 15 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里，有大有小，大的5k，小的0.3k。在293T细胞
里和包装质粒共表达做病毒，之后感染HeLa，再用puro筛。没感染的细胞都杀死了，感
染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光，转了小基因的细胞只有1%的是阳性，转大基因
的细胞都是阴性。westernblot也做了，小基因的能弱弱的看见，大基因的是阴性。质
粒序列没问题。
为什么puro抗性转进去了，我的基因转不进去？需要经验丰富的专家解答，谢谢。 |
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l*********1
发帖数: 351 | 16 想往一个细胞里转两个基因，除了使用拥有两个启动子的慢病毒表达载体外，由于实验
需要，我更希望把两个基因分别放到两个慢病毒表达载体（puro和hyg）中。现有两个
问题请教：
1）看到有人说先筛puro，再筛hyg，效率会比较高？有这样的理论依据吗？
2）能不能等比例预混两种病毒，MOI(0.5~1）侵染细胞，同时加Hyg和Puro，筛选双转
的细胞系？
感谢各位大神 |
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s*****i
发帖数: 315 | 17 Es cell 的话不要筛选太久、puro 两天就够了，电转后二十四小时开始加药，4天以后
就可以挑克隆了
质粒不用线性化也有很高的效率
: 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性
率大概
: 在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
: 我个人觉得要注意以下几点：
: 1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
: 2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在
同源臂
: PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
: 3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
: 4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好
，做之
: 前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
: 5.转染... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 18 1. 存活效率非常之低，低得令人发指
Try "conditioned" medium, which contains growth factor and cytokines blabla.
..
This trick works pretty much well for my neuroblastoma single cell
2.drug resistent markers，比如一个puro
I have horrible experience using puromycin, that you first establish "
survival curve" to figure out the optimal puro concentration to select those
puro-resistant,
but it seems everytime cell growth condition is slightly different, so the "
optimal" condition won't work at all.
3.Question: what's th... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 19 （CRISPR的背景资料请参阅Feng Zhang的“Genome engineering using the CRISPR-
Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）
背景
我们是作一个与激素相关的肿瘤的。这个肿瘤的治疗方法已经相当完善，就是让身体里
不能生产激素或用一个小分子化合物抢占激素受体上激素的结合部位。但多年治疗后，
会有相当比例的病人产生抗药性。这个抗药性机理相当复杂。我们实验室一直致力于筛
选和现有药物不同的机理的小分子化合物，包括受体和DNA的结合或其他与受体相关的
pathway的inhibitors。前几年成功地筛选出了几个不同机理的化合物，个别在细胞水
平达到了nM的级别，动物测试也在10 mg/kg的水平。
最近在这个领域对抗药性肿瘤的研究发现，部分病人的抗药性是因为受体激素结合部位
发生了突变。一个或几个氨基酸的突变就能导致肿瘤细胞的生长不能被现有药物抑制。
所以，我们很想知道我们筛选出来的化合物对这些突变受体是不是也起作用。理论上来
说，我们的化合物不和激素竞争，突变不会影响我们化合物的效果。但只... 阅读全帖 |
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h*****k
发帖数: 63 | 21 中间那首歌说的是 Caetano Veloso唱的Cucurrucucu Paloma吗，《春光乍泄》里也用
过这首。
Dicen que por las noches他们说每当夜晚来临
Nomas se le iba en puro llorar,他总是哭泣
Dicen que no comia,他们说他什么都不吃
Nomas se le iba en puro tomar,总是醉着离去
Juran que el mismo cielo当听到他的泣声
Se estremecia al oir su llanto;连天空都感动了
Que hasta en su muerte la fue llamando都还在叫着那个女孩的名字
Como sufrio por ella,知道他死前
Ay, ay, ay, ay, ay,... cantaba,哎呀呀呀呀,... 唱着歌啊
Ay, ay, ay, ay, ay,... gemia,哎呀呀呀呀.....呜咽着啊
Ay, ay, ay, ay, ay,... cantaba,
De pasión mortal... moria逝去的热情.. |
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l***y
发帖数: 4671 | 22 哪个公司的好用一些？
在看 Open Biosystems 的 TRIPZ lentiviral shRNAmir，以及 Sigma 的 pLKO-puro-IPTG-1xLacO 和 pLKO-puro-IPTG-3xLacO。看着都不错，就是不知道实际上是不是靠谱。
哪位大牛给推荐一下吧。。。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 23 这是肯定的，如果KD对生长有劣势。
可以试试增加puro浓度，但是puro表达和shRNA表达可能不是线性的。
要解决只能挑克隆了。 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 24 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 谢谢大家给了那么多的好建议！我一开始就想动手去改那个pGIPZ 里面的MCS site
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都... 阅读全帖 |
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c*******7
发帖数: 314 | 26 ft，为啥要puro select两到三周阿？太长了，2天就可以。2-3周我整个试验都做完了
。建议重新做一次，用早期的细胞看knockdown，我一般select完了立刻做wb。我的细
胞一直keep在半量的puro里面，3个礼拜之后好几个shRNA的knockdown明显就减弱了，
从90%降到50%knockdown |
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i*****g
发帖数: 11893 | 27 puro selection no guarantee stable knockdown
puro只要一点点 就可以保证细胞活下来
但是，表达一点点，未必能有足够量 miRNA shRNA production |
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J**l
发帖数: 493 | 28 update：
想问问大家，这事我应该跟老板讲吗？
不是要告状，只是想要陈述事实。我明天要跟老板单独开会，这个实验他一直知道的，
等data也等了几星期了，结果成这样。。我有跟那个postdoc的信件来往，第一封信上
说我需要从他那里要一些这个cell line（我用的original name as found in ATCC）
，他回信说没问题；然后就是今天给我的回复说给的细胞是modified，已经puro
resistant了。可笑的是我问他那细胞到底表达了些什么东西，还有我清楚记得他以前
用这细胞做过类似需要puro selection的实验，现在问他他全都避而不答。
我重新做实验需要时间，我想听听大家意见，是该告诉老板，还是就说自己搞砸了要重
来？
谢谢！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 29 是指puro selection吗？我想用的host cell transfection效率是不太高，是想用puro
来筛一下。就是不知道拿到double edited的机会高不高。
谢谢！
mutation |
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j******i
发帖数: 939 | 30 如果只有coding sequence的话 应该用2A或者IRES链接puro 否则的话 目的基因可能和
puro相互影响 |
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b******9
发帖数: 102 | 31 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性率大概
在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
我个人觉得要注意以下几点：
1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在同源臂
PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好，做之
前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。
6.donor载体我直接用的pBluescript SK(+)，转之前线性化处理一下。
7.阳性克隆鉴定有条件的话上southern，没条件用PCR吧，注意在同源臂外面设计引物。
8.再有就是防止细胞污染。 |
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发帖数: 1 | 32 思路挺好的，我也非常同意通过挑无数克隆再去做genotyping的工作量是非常恐怖的。
我不知道你是在思考这个strategy还是已经付出实践。如果你做的是human ESC，根据
我们实验室以及我一些朋友的经验，通过FACS把单细胞sort到96孔板里，即使全程都加
了ROCKi，存活效率非常之低，低得令人发指，和mouse ESC完全不是一个数量级的。我
的经验是大概一个96孔板能活5个左右，但是还不能确定karyotypes是不是正确的，以
及可能的假阳性。我更倾向于推荐使用drug resistent markers，比如一个puro，一个
neo。虽然neo的假阳性偏高些，但是single cell colony的survival要好非常多。同时
可以像你原本design那样加一个negative selection marker，比如GFP。
还有一个可能对你有用的hint是：可以设计两个gRNA去切除一段genomic DNA，然后只
用一个引入point mutation的donor （带puro）去做homologous recombination。可以
现在293细... 阅读全帖 |
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p********7
发帖数: 18007 | 34 Gang Names Street
Gang Prison
Gang Outlaw
Motorcycle
Gang Regional
Gang National
Gang Signs & Symbols
18th Street x x Colors: Blue, "18",18th St, "
10" "5" "3" , "XV3" , "XVIII" , Dies Y Ocho
52 Hoovers-Crips/SE 52 Hoovas x x Colors: Blue
/ Blue & Orange belts, bandana, Roman numeral 5 and 2 , 6 point star and/or
3 point crown , Pitch fork pointing up , 52HC , HGC (Hoover Gangster
Criminal) , 52 Hoovas
59 Bounty ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 36 我觉得元朝的奴隶还不少呢，下面就是一个
Ouro Puro
1 天前（修改过）
明朝是中國歷代王朝裡最獨裁的一個朝代，武當山張三丰祖師曾經在元朝為官，但在元
朝滅亡之後，明朝朱元璋曾經邀請張三丰至宮中為官，但張三丰祖師寧願隱居山林之中
，死也不肯當明朝的官，這就說明了明朝有多麼殘暴了！ |
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s***0
发帖数: 525 | 37 Castrol
Purolator Puro-One |
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s***0
发帖数: 525 | 38 Yep. Purolator Puro One is the one I use. |
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d*******s
发帖数: 15155 | 39 Mobil 1的不错，bosch的也还行。
别买Fram或者K&N的
楼上说的Puro One也不错 |
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q**j
发帖数: 10612 | 40 好像puro的oil filter好一点？但是Air filter呢？ |
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w**********p
发帖数: 559 | 41 Son by four - A puro dolor
one more time-Kenny G. ft. Chante Moore |
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k********k
发帖数: 5617 | 43 Many people speak English and Mandarin.
How many people who speak Mandarin (and English) can speak fluently a second
foreign language, such as French, German, Spanish, Russian, Italian,
Japanese, Korean, Arabic, and others?
It is hard to pronounce English (particularly British English) correctly.
It is probably even harder to pronounce (Parisian) French correctly.
Please try to read aloud any of the following versions in a second foreign
language: French, Spanish, Italian, and German.
Russian is... 阅读全帖 |
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R*s
发帖数: 2041 | 45 for stable transfection: u include a selective marker (such as G418,
puromycin) in the DNA construct will transfect cells with. Then by
including the antibiotics (G18, puro...) in the media, you will be
able to seletively grow up the cells trasfected with your construct, while
killing the untrasfected ones.
For transient transfection: you don't have such selective markers in
the constracuts. You will always grow cells in regular media. Since it
is impossible to achieve 100% transfection, there i |
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g*********r
发帖数: 59 | 46 I wonder whether anyone has experience on this retrvirus vector. Tried to
amplify it several time. the plasmid yield from most clones are super low.
Any way to solve this issue?
THanks! |
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a*****n
发帖数: 2835 | 47 try to transform again to DH5a,and make new preparations. |
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F**********e
发帖数: 158 | 48 you are right, this vector get a very low yeild
transform again may help a little
we just use much more bacteria |
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s******y
发帖数: 28562 | 49 Yes, it is very low.
What I did is I picked up several colonies from the plate and then compare
their plasmid yields.
The highest one will be used for plasmid production.
Even so, I still have to shake 500mL culture in order to get 250ug plasmids |
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g*********r
发帖数: 59 | 50 Glad to hear that. I thought I might make some mistakes during midi prep.
I also notice that sequence provided by addgene is not right. I tried to cut
it with kpni.the bands I got differs from predict. |
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