G******o
发帖数: 8 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: GenexBio (GenexBio.com), 信区: Biology
标 题: 销售工作：针对用Proteinase K genotyping PCR的朋友
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Nov 6 19:29:18 2014, 美东)
如果认识朋友是用Proteinase K处理小鼠组织做genotyping PCR，厂家寻求你的合作，
销售一个替代品试剂盒。
销售区域范围？
中国美国都可以，不需要你操心订货和运输。
厂家提供什么？
产品介绍，免费试用样品，和供货渠道，帮助你推销给你的朋友同事潜在客户。
你需要做什么？
花一点时间联系你的朋友，如果他们用Proteinase K处理小鼠组织做genotyping
PCR，询问是否愿意试用产家的免费样品。
你的朋友需要做什么？
试用一下免费样品。
你的收入怎么计算？
你接受客户的正式订货销售额的8-20%的作为介绍费报酬。
如何联系？
有兴趣请站内，多谢。 |
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G******o
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G******o
发帖数: 8 | 6 自定一次，多谢谅解。
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G******o
发帖数: 8 | 7 如果是自己做这个实验，我们公司也提供免费试用样品，请站内。
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a***l
发帖数: 32 | 8 proteinase K本身也是蛋白质啊，自己为啥不能消化自己啊，奇怪，其中有啥机理，告
诉下阿。。 |
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w****6
发帖数: 169 | 9 Proteinase K 主要攻击芳香族和脂肪族的氨基酸，这些氨基酸估计都被包裹在
porteinase K 的内部不暴露，而且其本身的结构非常稳定，像尿素，盐酸胍，SDS什么
的都不能使其变性失活，所以它很难被自己消化。 |
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G******o
发帖数: 8 | 10 如果你自己或者知道朋友用Proteinase K处理小鼠组织做genotyping PCR，厂家寻求合
作，销售一个试剂盒，中国美国都可以。
厂家提供产品介绍和免费试用样品帮助你推销给客户，然后客户正式订货销售额的8-20
%的作为介绍费报酬，有兴趣站内，多谢。 |
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S**********e
发帖数: 1789 | 11 给你看看我们系刚进来的助理教授
Vanderbilt University School of Medicine
Fingleton, Barbara Mary , Ph.D. Assistant Professor of Cancer Biology
Publications
Barrett, CW, Fingleton, B, Williams, A, Ning, W, Fischer, MA, Washington, MK
, Chaturvedi, R, Wilson, KT, Hiebert, SW, Williams, CS. MTGR1 is required
for tumorigenesis in the murine AOM/DSS colitis-associated carcinoma model.
Cancer Res, 71(4), 1302-12, 2011.
Koon, HB, Fingleton, B, Lee, JY, Geyer, JT, Cesarman, E, Parise, RA, Egorin,
MJ, Dezube, BJ... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 12 自己配的，
网上搜了搜，这是跟我们完全一样的protocol
Final concentration of tail digestion buffer (TDB):
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl (pH 9.0)
0.1 % Triton X-100
0.4 mg/ml Proteinase K
Add 100 ul of TDB per tail piece (2-5 mm) in a microcentrifuge tube. Be
careful not to cut too much tail.
Incubate the tube at either 60 C for 3 hours, with gentle mixing every 30
minutes, or 55 C overnight.
Incubate the tube at 94 C (or boil) for 10 minutes to denature the
Proteinase K.
Spin in microcentrifuge at top speed for 15 minutes. |
|
a***e
发帖数: 1010 | 13 we directly put cells in proteinase K, digest it, then inactivate proteinase
K, and then use the lysate as a template for PCR.
so it is shitty. |
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a***e
发帖数: 1010 | 14 depends how you do SNP mapping after that.
for us, just digest sample with proteinase K, then denature proteinase K,
then PCR, then restriction digestion. that's good enough. |
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s******y
发帖数: 220 | 15 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
谢谢了。 |
|
s******r
发帖数: 2876 | 16 给你一个最便宜的，
0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
谢谢了。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 17 DirectPCR lysis reagent (Viagen Biotech 102-T) and proteinase K (Viagen
Biotech 501-PK).
100ul lysis reagent + 2.5ul proteinase K, 55 degree O/N (>2hrs or more), 95
degree inactivate 15min
ready to go.
Sometimes you may need to consider DNA purification. |
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c********n
发帖数: 225 | 18 实验流程第三步：
3.Genomic DNA extraction
更新前
3-1 48-60 hours after transfection, cells are harvested by trypsin digestion
. Four wells of cells are combined into a 1.5 ml EP tube.
3-2 For genomic DNA extraction, 500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，
100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml）are added
into each tube and mixed gently and sufficiently. Bathe the tubes at 55℃
for 2 hours.
3-3 200 μl Tris-Phenol and 200 ul trichloromethane are added into each tube
and mixed gently and ... 阅读全帖 |
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V*****2
发帖数: 7930 | 19 对，或许这日本佬的例子不是很好。但是敢下结论确实很重要，想拿若贝尔奖当然得做
很多其他工作，不是简单下个结论那么简单。
Key publications
Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T. and Ohsumi, Y. (1992).
Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and
conditions for its induction. Journal of Cell Biology 119, 301-311
Tsukada, M. and Ohsumi, Y. (1993). Isolation and characterization of
autophagy-defective mutants of Saccharomyces cervisiae. FEBS Letters 333,
169-174
Mizushima, N., Noda, T., Yoshimori, T., Tanaka, Y., Ishii, T., Geo... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 20 AI Predicts Coronavirus Vulnerable to HIV’s Atazanavir
An international team of researchers turned to artificial intelligence to
quickly find potential anti-virals to test against 2019-nCoV. Using their
drug-target interaction deep learning model, they identified several
compounds—with the top candidates all targeting viral proteinases.
Atazanavir, which is used to treat HIV, was the best candidate. |
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f******I
发帖数: 769 | 21
antioxidants
you have to see a lung guy to get more detailed answers, to me clinically
COPD means emphysema, chronic bronchitis, and asthma, you can keep asthma
out of this since it seems to have different immune mediators with
eosinophils being involved,
for emphysema it is the destruction of small airways, you don't necessarily
have to have deficit endogenous production of alpha 1 anti-trypsin, tobacco
use, for instance, will activate macrophage and neutrophils to release
multiple proteinase |
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m******t
发帖数: 77 | 22 我同学在国内的生物制药公司，有种药国内没有，他想让我帮他问一下美国这边市场上
售卖的信息：
药物名叫 a1-抗胰蛋白酶（Alpha 1-Proteinase Inhibitor）， 想知道颜色，活性，
纯度等相关情况。有知道的不吝赐教
一下，或者告诉我去哪里查也行，CVS或者walgreen里面都得凭处方，也看不到啊。
多谢了！ |
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m*****m
发帖数: 18 | 24 Papers In Press, published online ahead of print January 4, 2005
J. Biol. Chem, 10.1074/jbc.M412900200
Submitted on November 15, 2004
Revised on January 4, 2005
Accepted on January 4, 2005
Crystal structures and amidolytic activities of two glycosylated snake venom
serine proteinases
Zhongliang Zhu, Zhi Liang, Tianyi Zhang, Zhiqiang Zhu, Weihua Xu, Maikun Teng,
and Liwen Niu
Department of Molecular and Cell Biology, University of Science and Technology
of China, Hefei, Anhui 230026
Corresponding |
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M****e
发帖数: 70 | 25 refer to NAR 1991 19:42 P.W.Laird et al
i have tried to optimize the condition and it works pretty
well for me. basically, cut ~5mm tail when the mickeys are
about 14-d-old (do not forget ear tag), if you worry about
cross-contamination, clean scissors with 70% ethanol and
flame, otherwise, i typically clean it after collecting 5
samples. digest the tail in a tightly sealed epp. with 500ul
lysis buffer, 5ul proteinase K (10mg/ml). rotate O/N at 55C,
though 6hrs is pretty much sufficient. spin 10 |
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j*****a
发帖数: 658 | 26 1。 proteinase inhibitor cocktail and phosphatase inhibitors 是要加的。他们
的作用是防止你在抽提蛋白的过程中蛋白讲解。在你一开始用pbs悬细胞的时候，如果
不加这两种抑制剂，会有蛋白降解。一般我洗细胞的时候就开始加。当然蛋白煮过变性
就不存在这个问题了。
2。 你的方法当然是可行的。5x sds page loading buffer 里就有detergent SDS，然
后再加热裂解，当然没错。如果你对自己的手平行操作非常confident，是完全可以不
测蛋白浓度的，直接加热完后run gel。 其实测蛋白的时候如果做的好一般情况下，
sample和sample之间浓度都是差不多的，校正和不校正是没有很大差的。所以你的做法
没有啥不对。只是你老板的做法是小学生式的，step by step, 也是classic的做法。
3. RIPA buffer是很强的裂解液，里面有几种detergent 组合，所以一般情况下裂解是
很完全的。就像上面的人说的，超声主要是打碎DNA，有点牛刀杀鸡了。
4。关于loading contro |
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D*a
发帖数: 6830 | 28 怎么我记得，proteinase K说明书上就写配好了抓紧用，不要放着让它们闲得发慌 |
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a***e
发帖数: 1010 | 29 proteinases are able to degrade themselves, but at a less efficiency,
comparing to degrade other proteins. |
|
X***n
发帖数: 366 | 30 Maybe not.
PFA cross-link proteins binding to RNA. You may try to heat to 65oC to
reverse the cross-link of PFA and add proteinase K to remove as much protein
as possible. |
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m******i
发帖数: 73 | 31 proteinase K 好象不行。 我想切成氨基酸，不是多肽。
请各位建议以下。 谢谢。 |
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h*****t
发帖数: 1226 | 32 If the lysine is modified, maybe enzyme can not cut around lysine residues
Proteinase K, and Pronase are pretty effiecnt enzyme to non-specifically
cut proteins
very
. |
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X***n
发帖数: 366 | 33 Try toluene and serial ethanol to remove paraffin and rehydration.
Digestion at 60oC with proteinase K to release RNA and protect from RNase
degradation. |
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w***a
发帖数: 4361 | 34 lysate buffer得专门配吧，至少得有proteinase inhibitor那些
你的蛋白搞不好degrade了。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 35 我以前在国内时候提细菌基因组用的方法，貌似对酵母也work,我以前就提过一次酵母
，确实work的很好，还记得gel上的照片贼亮贼亮的。那时候年轻啊！问过别人，说
lysozyme对yeast也能work.
Extraction of DNA from Bacteria and Yeasts
(This protocol was developed by Housepainter on February 09, 2010)
1.Inoculate 5 ml of medium with a single colony of transformed bacteria or
yeasts.
2.Pour 1.0 ml of the culture into a tube. Centrifuge at maximum speed for 30
seconds at room temperature. Remove the supernatant.
3.Resuspend the bacterial pellet in 1.0 ml 0.85% NaCl by vigorous vortexi... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 220 | 36 不小心被扎了，扎的不深，但是出血了。
针里是小鼠组织放在buffer里面，组织已经被homogenize过了
那个buffer里面都是好东西，dtt, sds,还有proteinase inhibitor，
我用dd water冲了，然后又用酒精冲了， 把血挤出来了一点，然后用bandage包了。
不会有问题吧，要去医院吗？
已经半个小时了，不会明早起来，手就没法用了吧？
好害怕啊.
求救！！！！ |
|
e*****n
发帖数: 15 | 37 哎，都博士二年级了，还问这样的问题，真不好意思
我是用qiagen blood & tissue kit 提brain tissue的DNA，~ 20 mg， handbook上面
说 brain tissue的话25mg 的DNA 产量 15 ~ 30 ug， 那理论上我应该得到12 ~ 24 ug。
但是我做了几次，最好的那次是200ul elution buffer，浓度 ~ 30 ug/ml, DNA 总量
是6 ug。
今天又做了2个sample，200 ul elution buffer，浓度只有10 ug/ml, 再用新的100ul
elution buffer, 浓度~10 ug/ml， DNA 总量大概只有3 ug。跑了一块胶，可以确定是
有DNA的。
实在想不出来是什么原因。 我disrupt tissue的时候是用23 G的needle做的，然后加
proteinase K消化了6个小时，液体很澄清，应该不会是消化的不好吧。很简单的实验
，就是做不好，哎。。。。
Sample比较珍贵，不敢再做了。。。希望大家能帮我一下啊，谢谢大家！！ |
|
D*a
发帖数: 6830 | 38 Quick Tail Prep
Collect mice figure/tail in 0.5 ml Eppendorf tube. (4 mm is enough)
Add 100 microliter of quick tail digestion buffer (below).
Incubate at 55 C for 2 hours to overnight.
Vortex and incubate at 95 C for 10 minutes.
Centrifuge for 5 minutes to get rid of the small pieces of undigested sample.
(NOTE: I do neither vortex nor centifuge, and my pcr works
but if you vortex, you have to centifuge)
Use 1-2 microliter aliquot of supernatant for a 25-50 microliter PCR
reaction (or whatever ... 阅读全帖 |
|
a*****g
发帖数: 543 | 39 proteinase K还是很便宜的吧？
这样出来的Quality能好很多。
曾经用过一个植物提取DNA的方法，NaOH 煮10分钟，加HCL中和， 直接用来做PCR。 不
记得浓度了（应该是1N左右）。
这样的quality很差，尤其是false negative. |
|
s******s
发帖数: 13035 | 40 kao, proteinase K 100块钱不到能买100mg （sigma)，你这个老鼠能搞250个，
要省钱这个也省不出来啊 |
|
s*******t
发帖数: 7746 | 41 SiRNA is NOT specific.
use Morpholinos oligos (made by Gene Tools,LLC, http://www.gene-tools.com/). It is antisense oligo with high specificity, stable in the cells (can not degraded by RNAase or DNAase or Proteinase etc). I have used Morpholinos in cell culture and mouse. Work really well. |
|
j****t
发帖数: 1663 | 42 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl（instead of 0.
5%）,和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
对于IP 来说还是高了些，我会在做IP前把sample稀释一倍。
我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了，问题说不定是在reverse-
crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下，供你参考参考。
Check chromatin size and conc.
1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
tube).
2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) ... 阅读全帖 |
|
s******e
发帖数: 370 | 43 Zymed 的prepgem
不过我个人喜欢用MGB＋proteinase K，55C 30 min 来digest 胚胎tissue，如果时间
不是特别紧张的话 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 44 Quick Tail Prep
Collect 1 mg skin biopsy (= normal size tail or figure tip) in 0.5 ml
Eppendorf tube.
Add 100 microliter of quick tail digestion buffer (below).
Incubate @ 56 C several hours to overnight.
Vortex and incubate @ 99 C, 10 minutes.
Centrifuge @ max speed, 5 minutes.
(NB i don't vortex so i don't need to centifuge the tube, it works)
Use 1-2 microliter aliquot of supernatant for a 25-50 microliter PCR
reaction (or whatever you routinely do).
Transfer supernatant to a fresh tube for s... 阅读全帖 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 45 Quick Tail Prep
Collect 1 mg skin biopsy (= normal size tail or figure tip) in 0.5 ml
Eppendorf tube.
Add 100 microliter of quick tail digestion buffer (below).
Incubate @ 56 C several hours to overnight.
Vortex and incubate @ 99 C, 10 minutes.
Centrifuge @ max speed, 5 minutes.
(NB i don't vortex so i don't need to centifuge the tube, it works)
Use 1-2 microliter aliquot of supernatant for a 25-50 microliter PCR
reaction (or whatever you routinely do).
Transfer supernatant to a fresh tube for s... 阅读全帖 |
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x***o
发帖数: 47 | 46 是 Cysteine proteinases，多谢，先看看 |
|
h******u
发帖数: 602 | 47 是从HYBRIDOMA来的单抗。一直都是收集细胞培养的MEDIUM，直接用做免疫组化和
WESTERN。用几次后就扔掉。
现在想节约点，除了分装小体积，避免多次冻溶，是不是还可以加点proteinase
inhibitor？ 别的招呢？ |
|
c*****n
发帖数: 233 | 48 为了降低DNA/蛋白污染，我可以在RT之前用DNAse和Proteinase处理吗？要是可以的话
，应该怎么做？ |
|
b******r
发帖数: 111 | 49 Thank for the message of you both.
"你怎么抽DNA的，测纯度没有，浓度怎么测的"
-->lysis buffer containing proteinase K digests mouse tail overnight at 65
degree. Phenol/chloroform isolates, ethanol precipitate. Dissolve in TE
buffer(pH7.5). 280/260 ratio=1.7-1.9, 浓度=0.2-0.5ng/uL
I tested 7 forward primers x 15 reverse primers. The totally primer pairs
are 105. All works well to PCR 1fg of plasmid which contain target gene, but
always don't work when template contains both 1fg of plasmid and 0.1ng of
mouse genomic ... 阅读全帖 |
|
g*****n
发帖数: 250 | 50 It turns out as I suspected that something inhibited your enzyme. It is
phenol. You don't need to purify genomic DNA for genotyping. You can just
simply heat up your tail preps to 96oC for 10 min to kill proteinase and
take a bit from the preps for PCR. |
|
