o*****a
发帖数: 2335 | 1 最近也在看这些技术文章，似乎如果染料结合没饱和的话，这么做也不一定比house
keeping genes差。前不久看过的一个全蛋白做normalization文章：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2567873/?tool=pubme
另外还有个半定量western的文章提到Ponceau S的局限
It has been found that images acquired with fluorescent staining are better
suited for quantification compared to Ponceau S. This is connected to the
fact that a color staining such as Ponceau S darkens the membrane locally.
Since the color of the membrane cannot become darker than that of the pure
staining color, the... 阅读全帖 |
|
f***r
发帖数: 204 | 2 还在与PVDF战斗中，再次请教有经验的虾们：
终于看到了条带，但是巨多非特异带，比我要的带都强得多。在网上查到多家western系
统的trouble shooting，里面提到的好几条关于high background的建议让我大开眼界，
又困惑非常，因为矛盾很多：
1. 关于tween的使用：有一家建议blocking之后才用tween，否则tween会stick to the
membrane and cause high noise；但很多常规方法都没有提到这一点。
2. 关于blocking reagents和ab incubation buffer：有说dry milk能reduce
sensitivity，所以如果只用在二抗incubation就能很好降低noise，但也有很多全程用dr
y milk的，也有说dry milk与tween联合使用会提高noise的；有说BSA会造成高背景的，
也有说用BSA可以获得理想信噪比的……
3. 关于ponceau s染色：这次为确证transfer有效，用了ponceau s染色，但发现有资料
说ponceau s就算洗干净也会 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 3 一般都是normalize到house-keep genes，对吧。
你们见过normalize到ponceau S staining的吗？
读了篇paper，里面是那样弄的，
转完膜，Ponceau S染，然后记录下来，说为了保证equal loading，
然后再用抗体得到specific signal, normalize到corresponding Ponceau S signal。
。。
我从来没有见过这么做的，也觉得这么做是不对的。
大家的意见呢？
谢谢。 |
|
r******a
发帖数: 31 | 4 同一个蛋白complex纯化后分别做silver stain，coomassie stain以及转膜后的
ponceau stain，结果差异很大。具体点说在silver stain上可以看到所有subunit，而
且都是equal intensity的非常strong的band，但是在coomassie stain和ponceau
stain上只可以看到2条，另一条消失了？silver stain条带的强弱和蛋白量的多少关系
不大，band强不一定代表量多对吧，但是不至于在coomassie stain和ponceau stain上
一点都看不到啊... |
|
i***l
发帖数: 1656 | 5 1. Ponceau is not sensitive enough and your samples are composed of many
bands each with low quantity of protein
2. ponceau may not be able to stain certain proteins in your fractions |
|
z********8
发帖数: 818 | 6
多试试几个house keep 基因。
每次转膜后Ponceau S staining，拍照。如果house keep基因不行，就用Ponceau S
staining. |
|
N*******e
发帖数: 3872 | 7 当下，中印的边境对峙已经进入关键时期。近日，有印度电视台曝光了一段时长约1分
钟的对峙现场视频。
视频中可见印度士兵和解放军官兵在现场做出环抱、推搡抢夺拍摄设备等动作。
洞朗作为中印不争议区，原本为不丹实控，设有季节性哨所，2007年中方公路修至洞郎
恰尔塘，解放军边防6团摧毁了不丹哨所，2014年在洞朗最西南中印边境设立庶草场哨
所。
此次中方要修通前往庶草场哨所公路，彻底完成对于洞郎地区实控，洞郎距离印度七寸
西里古里走廊（印度东北部最窄处）只有几十公里。
一旦中方实控洞郎，印度在包括藏南在内的东北邦驻军，战时有被围歼的危险，触动印
度最敏感神经。
这个位置每前进一步都是向印度胸口插刀子，即使纯属中印不争端地区，印度拼了老命
也要阻止中方修路。
2014年，中印曾发生支普齐对峙。支普齐方向印度补给较易，而支普齐距北京7,200公
里，道路艰险，中方从2005年开始费时8年才将公路修进支普齐，并于2013年成立支普
齐边防连，设立支普齐哨所。
2014年为争夺长期为印度实控的勒马尔列莎仓纳通道，中印3,000人对峙26日，印度同
样试图阻止中方将公路修入勒马尔列。
由于该地段补给困难... 阅读全帖 |
|
c******a
发帖数: 4400 | 8 Dorje Ponceau??????
looks to be a made up person |
|
h**2
发帖数: 2841 | 9 老弟/老妹，很多实验室都有自己的习惯，尤其是你做phd的话人家assume你是张白纸，
谦虚小心点follow他们的习惯总不会错。
虽然你的这个实验beta actin是匀的，但对于你的这个方法对establish自己的实验系
统很不好。
首先以后你可能会碰到细胞数在transfection/infection之后变化很多，其次你用pbs
冲下来的话也可能漏掉一些，这些都是很可能的，实验多了的话难免出错，但你最快也
要等到running/transferring之后用ponceau S才能知道，浪费时间啊。至于裂解的话
找个标准的protocol用RIPA来做吧，算是经典方法之一，不想配的话公司有卖的。记得
加上protease inhibitor和phoshpatase inhibitor (thermo)也有卖的
我老板平时都不管学生，但每个新生进实验室一般迟早都会被骂一次，算是整个phd培
养过程唯一一次micro-management，常常会说it's scientific research, not
cooking!开始也有点不服气，但后来慢慢意识到每一步仔细一点，其实整体上 |
|
w**********s
发帖数: 72 | 10 用ponceau S 染色时看不到明显区别。如果样品盐浓度不均匀是不是说我得loading
buffer有问题？非常感谢！ |
|
s***i
发帖数: 160 | 11 周一到今天连续每天跑两个胶
结果每个都有问题
取成年小黑鼠样本
测PDK1，P-PDK1 还有其他protein
第一次的样本是上星期做的，结果pdk1 和P—pdk1 各出来bands，PDK比 P-PDK弱，第
一个不解
怀疑操作有问题，另取样本重新制作，第二次PDK没显示出来，P-PDK却一直存在，只不
过对比第一次稍弱
因为只load10ug跑胶，怀疑太少重复第三次，20ug，其他条件和第一次一样
结果PDK1还是没有显示 P—PDK1有显示
怀疑抗体浓度不够，今天使用一抗和二抗都用1：500，之前一直用1：1000
换用TPS—T 冲洗，之前都用PBS—T
另外操作过程反复检查过，把蛋白转到膜后ponceau检查没有问题，5%nonfat milk
incubate 1.30小时，冲洗都足15min，一抗体4度冰箱过夜，冲洗三次后二抗两小时，
再冲洗三次。抗体用的是cell signaling technology的。
百思不得其解，为啥第一次显示得出来~
另外同在一个胶跑的还有AKT和P-AKT，AKT显示正常，就是P-AKT有超多nonspecific
bands，有什... 阅读全帖 |
|
a*****x
发帖数: 901 | 12 但似乎拿Ponceau staining没有问题啊 |
|
s********n
发帖数: 2939 | 13 Ponceau S staining is usually after transferring but before 1st blocking. |
|
b*********8
发帖数: 44 | 14 转完膜后用Ponceau S 染膜会不会影响后续的杂交？
Y |
|
s******y
发帖数: 28562 | 15 什么样品？用什么胶跑的？转到了什么膜上面？
你有没有用Ponceau S 染染看蛋白是否转过去了？
如果你的样品里有actin 的话，即使转膜不完全，不可能一点都看不到的，
如果什么都看不见，那就有几个可能：
1。 你的二抗坏掉了，或者你的WB reagnet 有问题。 这个是最有可能的。
2。你跑的样品根本就不是普通的真核细胞的样品。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 16 如果其他带都能看见（你说的那些什么size marker 那个可不算数），
而且用ponceau S染色后有都能看见蛋白的带的话，看不见actin 那真是见鬼了 |
|
|
r******k
发帖数: 446 | 18 If i used whole cell lysis ( with our cell fractionation), i saw very
abundance of protein bands with the stain of ponceau S. However, after i
fractionated the sample, it seems nothing can be detected, even in the
cytosol. I have no idea why. 难道cyto/nucleus被抽出来的过程会使得蛋白降解？ |
|
O**********a
发帖数: 317 | 19 很简单，我给你个protocol：
1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
清晰的三条组蛋白带（H3、H2A／2B，H4），一般还能看到上面一条组蛋白H1。weste... 阅读全帖 |
|
