B****n
发帖数: 22 | 1 最近需要在iPS里同时表达多个基因，老方法一轮又一轮的转化然后筛选似乎不成。
有人建议我用piggybac，可以同时转化多个基因。听上去挺好，不知道实际操作起来怎
么样？毕竟都换成piggybac，没有一两个星期搞不定阿。
那位有经验的前辈给个建议。 |
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c**i
发帖数: 6973 | 2 Michael Wines, A U.S.-China Odyssey: Building a Better Mouse Map. New York
Times, Jan 29, 2011.
http://www.nytimes.com/2011/01/29/world/asia
/29china.html?_r=1&scp=1&sq=fudan&st=cse
Note:
(a) Tian Xu, PhD, Department of Genetics, School of Medicine, Yale
Universoty, undated.
http://medicine.yale.edu
/genetics/people/tian_xu.profile
Quote:
"Professor of Genetics; Vice Chairman of Genetics; Investigator, Howard
Hughes Medical Institute; Director, Yale Center for Functional Genomics"
"Education[:]... 阅读全帖 |
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c**i
发帖数: 6973 | 3 Michael Wines, A U.S.-China Odyssey: Building a Better Mouse Map. New York
Times, Jan 29, 2011.
http://www.nytimes.com/2011/01/29/world/asia
/29china.html?_r=1&scp=1&sq=fudan&st=cse
Note:
(a) Tian Xu, PhD, Department of Genetics, School of Medicine, Yale
Universoty, undated.
http://medicine.yale.edu
/genetics/people/tian_xu.profile
Quote:
"Professor of Genetics; Vice Chairman of Genetics; Investigator, Howard
Hughes Medical Institute; Director, Yale Center for Functional Genomics"
"Education[:]... 阅读全帖 |
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l*******i
发帖数: 153 | 4 Piggybac作为gene delivery tool还是不错的，但是不能应用于基因治疗，是一个大的
缺陷。
许田的主要问题还是他的那个用piggybac制作基因敲除小鼠的宏大项目。好几年前就听
说复旦给许田一栋楼，养上万只小鼠，就是为了这个项目。谁知CRISPR技术这么快就出
来了，直接砸了许多人的“饭碗”，许田也算其中一个“受害者”了。
非病毒类整合性载体，比如piggybac，sleeping beauty在基因治疗方面还是有很大优
势的。目前，在欧美都有sleeping beauty的基因治疗临床试验在开展. |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 老兄，你有没有helper transposase 啊？
我实在是找不到能在mammalian cells 里面用的helper, JHU 的 Nancy Craig 说因为她
做的那个质粒涉及到版权问题不能给别人用，而Notre Dame 的Malcolm J. Fraser主要是
做果蝇里面用的，他们的清单里（http://piggybac.bio.nd.edu/）
唯一一个貌似能够在mammalian cell 里面用的helper 是 p3xP3-DsRed1-orf （ The
CMV promoter driven piggyBac ORF helper plasmid. Also contains a 3xP3
controlled DsRed1 genetic maker）。
但是我们要转进去的蛋白正好也是红色的，我不知道这个helper 会不会把它自己的质
粒包括DsRed1 genetic maker 也一道stably转进去？如果也会的话那我们就不能用了！ |
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a*****x
发帖数: 901 | 6 piggybac是随机插入。克隆到piggybac质粒应该不难，就是酶切再连接。难道你已有的
质粒没有多克隆位点了？helper质粒你应该可以问那个发文章的实验室要到。
在 sunnyday (飞鱼) 的大作中提到: 】 |
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j******i
发帖数: 939 | 7 IRES确实会导致不平衡表达，以致后边的gfp表达强度弱，但是正常情况下，也应该是
90-100% transfection efficiency,只不过gfp看起来很暗。如果要建立高表达细胞系
的话，可以不要gfp, 最后检测proviral DNA或者mRNA.
其实，你这个情况完全可以不用慢病毒。用piggyBac转座子更方便。piggyBac可以插入
100kb的dna。 |
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发帖数: 1 | 9 你们是在什么细胞系里边做的呢？
这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
有问题的。
通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
homozygous |
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发帖数: 1 | 10 GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
donor backbone
通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
源臂，
突变成功。
在设计左同源臂和右同源臂的时候，选择带有ttaa的位点分界，ttaa不要包括在同源臂
内。
说到这里，你是不是应该去补习一下基础理论知识。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 11 fudan现在到底养了多少老鼠了？
那个piggybac到底搞了多少mutants？ |
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s**u
发帖数: 9035 | 12 发信人: Morphin (莫非-白衣“追鱼”郎), 信区: Faculty
标 题: Re: 复旦发育生物学研究所所长许田, working in Yale or Fudan?
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 8 10:45:15 2011, 美东)
fudan现在到底养了多少老鼠了？
那个piggybac到底搞了多少mutants？ |
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s**u
发帖数: 9035 | 13 发信人: Morphin (莫非-白衣“追鱼”郎), 信区: Faculty
标 题: Re: 复旦发育生物学研究所所长许田, working in Yale or Fudan?
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 8 10:45:15 2011, 美东)
fudan现在到底养了多少老鼠了？
那个piggybac到底搞了多少mutants？ |
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M*****n
发帖数: 16729 | 14 this commetator is mean.
Piggybac is great, though transposons are never as unbiased as chemical
mutagens. |
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p*****m
发帖数: 7030 | 15 他那个piggybac的bias很严重 等到deep sequencing的价格下来了 他的系统也就没用
了：大家直接ENU突变然后上sequencing就好。其实现在已经有人这么做了 |
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b****n
发帖数: 311 | 16 许田的老鼠一点都不让别人用，这是他最大的问题。自己想独吞，能吞多少。而且
transposon mouse mutagenesis 他也不是独家。记得sleep beauty做老鼠cancer是和他同一年的
paper。piggybac 后来mario capecchi lab重新做了一遍，再加了些改进。capecchi lab 的一
作现在在交大都是973首席了。
许田在复旦要建mouse mutant library,差不多6年了，没见有什么有意思的东西出来，
当然有可能在酝酿爆发中... |
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b****n
发帖数: 311 | 17 许田的老鼠一点都不让别人用，这是他最大的问题。自己想独吞，能吞多少。而且
transposon mouse mutagenesis 他也不是独家。记得sleep beauty做老鼠cancer是和他同一年的
paper。piggybac 后来mario capecchi lab重新做了一遍，再加了些改进。capecchi lab 的一
作现在在交大都是973首席了。
许田在复旦要建mouse mutant library,差不多6年了，没见有什么有意思的东西出来，
当然有可能在酝酿爆发中... |
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s**u
发帖数: 9035 | 18 发信人: Morphin (莫非-白衣“追鱼”郎), 信区: Faculty
标 题: Re: 复旦发育生物学研究所所长许田, working in Yale or Fudan?
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 8 10:45:15 2011, 美东)
fudan现在到底养了多少老鼠了？
那个piggybac到底搞了多少mutants？ |
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j******i
发帖数: 939 | 19 是的。凡是DNA载体，不管是非插入病毒还是plasmid载体, 都有部分会随机插入基因组
的。这种整合效率很低，一般为0,01-1%. 不想接触病毒，又想获得高整合效率，可以
考虑使用转座子系统，比如sleeping beauty or piggybac. |
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j******i
发帖数: 939 | 20 transposon有很多 你指哪个啊 sleeping beauty? piggybac? 而且同一个transposon
有不同的升级版本。 |
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a*****x
发帖数: 901 | 21 可以用piggybac system共转helper transposase,这样整合几率就很高了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 谢谢，但是那个文章里说的那个方法需要重新做克隆。我们的那个质粒太大，实在是没
有勇气
再重新克隆一次。
另外，piggybac 是否需要特异的识别序列？我想要的其实就是一个能够增强随机插入
的helper 而已，如果要插入的基因需要特别的识别序列的话又得再做克隆。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 要再克隆会非常麻烦，因为需要把promoter 和poly-A tail 都克隆进去，一方面是会
非常
大,另外一方面是可能会找不到任何合适的酶切位置（因为promoter 和poly-A tail 外
围的酶切位置本来就不多，就算有也很可能正好在我们的fusion protein 上同时也有
切点，另外还要看是否和piggybac里面的克隆位置compatible，实在是不看好。
我更感兴趣的是：如果我的质粒不在那个piggay vector 上，光是表达helper
transposase，
能否增进我的那个质粒的随机插入几率？ |
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a*****x
发帖数: 901 | 24 No, that won't work, at least in theory. You may insert the piggybac
sequence into your vector then -- should not be hard. Or you may try more
transferring conditions |
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s********r
发帖数: 312 | 25 piggybac真心好用，用lipo共转mES连克隆都不用挑，有了它以后再也不用做
electroporation了。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 我本来都已经打算不用了。。。听你这么一说，又让我的兴趣上来了。
你们的piggybac 系统哪里要来的？克隆plasmid的时候怎么处理的？ |
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l*******i
发帖数: 153 | 27 我们实验室就是做转座子。piggybac转座效率还可以，但是像viral vector一样,对
trangene的大小敏感，超过7Kb，转座效率（转座子整合进基因组的效率）就会急剧下
降。
不建议把转座子和转座酶（helper）克隆在一个质粒上，这样会导致质粒太大而降低转
染效率。
另外，转座子和转座酶的比例不是在1:1时，转座效率最高。对多数人和小鼠的细胞来
说，转座子和转座酶比例在5:1 - 10:1时，转座效率最高。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 请教如果是插入突变，就是便于PCR找到插入位置的，
最新最方便的方法是什么啊？记得前两年好像有piggybac
啥的，不知道有没有成熟的paper或者更好的方法 |
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j******i
发帖数: 939 | 29 转染效率跟哪种细胞有关。CRISPR+ssDNA要拿到想要的克隆还是挺费劲的。可以考虑
CRISPR+piggybac＋puroTK的结合来筛选克隆。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 30 许田弄出piggybac，这个牛逼大了，
不能要求他动不动就有这个级别的成果吧 |
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o**4
发帖数: 35028 | 31 具体机理不清楚，
不过我们几个大基因，用别的系统都不行，只有piggybac非常好使 |
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o**4
发帖数: 35028 | 32 就是正常转染piggybac载体，就会整合到基因组稳定表达 |
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j******i
发帖数: 939 | 33 piggybac用plasmid表达的话很容易多拷贝 所以表达量不会低 当然 也可以用极低量的
PB transpoase 然后多筛选几个单拷贝克隆 其中有的克隆表达量会低 |
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s********r
发帖数: 312 | 34 转染效率高的话不需要做single colony，推荐用piggybac系统，超级方便，不用挑克
隆，筛一个星期就能养起来做实验了。 |
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L****T
发帖数: 169 | 35 Most people in this field are now using piggybac vector with CAG promoter |
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发帖数: 1 | 36 piggybac系统是可以做到完全foot-print free的 |
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z****u
发帖数: 1007 | 37 不太明白这点，piggybac过表达难道不是引起transpose跳转吗？不明白为啥会把俩itr
间的序列切除掉？
变。 |
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j******i
发帖数: 939 | 38 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧 |
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发帖数: 1 | 39 在人的干细胞里边，除非你使用那个ssODN，这个据很多人反馈是你不筛够2000个克隆
，想都不用想成功。另外能够想到的foot-print free的编辑方法就是结合piggyBac了。
确实不太方便，文章里边报道的加个HSV-DTK，使用FIAU做阴性筛选，百分之60-70.实
际效果是，筛选70-80个克隆，有一个抗FIAU的克隆是成功去除掉了筛选标签。 |
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发帖数: 1 | 40 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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m****g
发帖数: 530 | 41 教育部学位与研究生教育发展中心网站日前公布2009年全国优秀博士学位论文评选结果
，入选的98篇优秀博士学位论
文，涵盖哲学、经济学、法学、教育学、文学、历史学、理学、工学、农学、医学、军
事学、管理学12个学科，来自北
京大学等69家单位。名单自公布之日开始，进入为期60天的异议期。
自入选论文名单公布之日起60日内，有发现入选论文存在学术失范行为，或论文的主要
研究成果不能成立等严重问题
者，可以书面方式向教育部学位管理与研究生教育司提出异议。提出异议的书面材料应
包括异议论文的题目、作者姓
名、学位授予单位名称、异议内容，支持异议的具体证据或科学依据，以及提起异议者
的真实姓名、工作单位、联系地
址、联系电话等（如需保密，请注明）。有关材料请直接寄送教育部学位管理与研究生
教育司（地址：北京市西单大木
仓胡同35号，邮政编码：100816）。
异议期结束后，全国优秀博士学位论文由教育部和国务院学位委员会批准。
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