l********t
发帖数: 2 | 1 pcdna3.1 v5-his和PCAGGS-GFP磷酸钙共转染原代神经细胞，然后染色GFP和V5tag，GFP
信号很强，但是V5信号非常弱，表达很低。但是HEK上共转染，GFP和V5都很强。是因为
PCDNA的promoter在神经细胞里不太好使吗？考虑要不要subclone到pcaggs载体里去。 |
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w*******i
发帖数: 477 | 2 求助， 请问哪位战友有 pcDNA dest40 （gateway) ，可以寄我一点吗？ 谢谢。 请
站内 |
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z*********s
发帖数: 38 | 3 最近用pCDNA 3.1+质粒表达蛋白，请问质粒是在哪个位置被切开加上polyA尾巴的，具
体是怎么样一个过程？ |
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S******y
发帖数: 2 | 4 as i can recollect, pcdna was generated by synthesis. |
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b******r
发帖数: 111 | 5 Note: NHEs is membrane proteins that transmembrane 12 times. NHE5 is
localized to the plasma membrane;NHE6-9 reside on organellar membranes(
endosome,Golgi);
1. pcDNA transfects NHE5-9 through Fugene 6(ratio is 3 uL of Fugene/2 ug of
DNA) in 293 cells. After three days,collect cells.
2. Cold PBS washes cells. Add 150 uL of lysis buffer(final concentration:
50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% triton, 0.1% sds, cocktail inhibitor)
into each well of 6-well plate. Scrape cells.
3. The lysate gets st... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 6 谢谢牛牛。
1。我设计引物直接把ORF从pcdna质粒上扩增出来，然后装入pENTR，再到destination
病毒载体。
pcdna质粒表达没有问题，wb检测多次；pENTR也测了序。kozak序列倒是没有，因为
pcmv是强启动子。我将试试单转lentiv vector.看看表达与否。
2。p24是病毒的蛋白吗？
3。infection效率不知道。我要老老实实地作一次。 |
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p*******r
发帖数: 156 | 7 最近本人在将一个6000-8000bp连接到pcDNA 3.1（+）(5400bp)中去, 使用普通的连接
酶至今都没有连接进去，真心向各位大虾请教，大家通常如何使用什么神奇的连接方法
和kit,thanks a lot |
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c*******r
发帖数: 440 | 8 1. 是不是转染的外源基因片段越小越容易整合？ 多大的片段不容易整合（既极限有多
大）
2. 如何筛选悬浮细胞的稳定表达系？ （用G418） 要挑琼脂糖板吗？ 本人只做过贴壁
细胞的筛选，方法有什么不同？
请做过该实验的多多指导，多谢！ |
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z*******6
发帖数: 679 | 10 还在rotation选实验室，有个实验室蛮喜欢，方向什么的都还行，实验室宽松，有钱，
paper也还可以，能发个pnas，唯一感觉不放心的就是之前有篇pnas paper的数据有问
题，但不是他们故意的，发了之后才发现细胞系污染了，当初用的A549最后不知道怎么
变成Hela了，他们就当作A549发了paper。。。这种事情会不会被发现以后影响老板的
credit，对我以后影响也不好。。。
大家怎么说？
PS 主要还是觉得实验室有钱，花起来基本不用考虑的，前阵子就为要个带另一个抗性的pcdna，稍微做个克隆估计就出来了，或者borrow一下也不是多大的事，然后基本想都没想就从invitrogen上买了，500多刀，我看着就心疼，后来貌似就没用上。。。枪头什么的也都是买现成的带filter的。。。我以前呆过没钱的国内实验室，做起实验来真郁闷，所以了。。。
另外就是课题比较吸引我，刚拿到的一个R01做HIV的，貌似用他们的系统有希望搞定HIV似的，不小心激发了我的一点点野心。。。 |
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i******m
发帖数: 495 | 11 不好意思，没看出来这个实验室特别有钱
我用vector从来都是买的
借来的东西没有保证。 自己以前吃过这个亏， 看到身边的人也吃过这个亏， 所以
就直接买了。 filtered tips。。。没多少钱吧
性的pcdna，稍微做个克隆估计就出来了，或者borrow一下也不是多大的事，然后基本
想都没想就从invitrogen上买了，500多刀，我看着就心疼，后来貌似就没用上。。。
枪头什么的也都是买现成的带f
HIV似的，不小心激发了我的一点点野心。。。 |
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o*****a
发帖数: 2335 | 12 歪个楼请教一下，你的pCDNA转染293后能稳定保持多长时间？为什么有人说传几代后就
没了 |
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c********u
发帖数: 250 | 13 最近克隆了几个基因进Invitrogen pcDNA 3.2/V5-DEST，测序什么的都没问题，可是在
293细胞表达后用invitrogen自己的anti-V5做immunocytochemistry的时候总是有比较
强的background staining，我用的是10% goat serum blocking and goat anti-mouse
Alexa 594.请问哪位用过这个antibody，什么条件可以降低噪声呢 |
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s*********y
发帖数: 387 | 14 处理了大概30个质粒，还有30-50个需要大提，
处理的30个中，主要是pCDNA和peGFP的质粒，插入大概3k 到 8k的基因片段
部分比较好，150ml菌，能有1000ng per ul浓度，有1ml体积
部分比较的诡异，浓度只有30 ng per ul，在1ml的体积中。
但是测序的 时候 都是 对的！！！！而且浓度低的 mini prep没有任何的问题
浓度在200 ng per ul，体积在 50ul |
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a****d
发帖数: 1919 | 15 CMV is a weak promoter. pcaggs is much better for gene expression in neurons
. |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 5'
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG 3'
I am currently designing a transgenic vector, I cloned this BGH polyA signal
from PCDNA 3.0
could anyone here familiar with it help me to check if this poly A signal is
complete enough? |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 我是按照invitrogen PCDNA 3.0的annotation做下来的，以前吃过别的质粒的亏 (那个
质粒只把部分GT rich region标出来，turns out不够)
transgene
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG |
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c********u
发帖数: 250 | 19 Invitrogen Gateway C-terminal GFP destination vector pcDNA-DEST47 克隆的蛋白
为什么不亮呐？非得每次再用anti-GFP染一遍才有暴亮的荧光，为啥啊为啥，有没人碰
到过同样的问题？ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 20 谢谢。以前用pcdna座的稳定转染也应该是单拷贝的，但是表达还可以阿。 |
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r*****t
发帖数: 4793 | 21 建了一个质粒，pcdna 的表达His9（6-FLAG tagged 一个基因
用最开始得到的质粒作转染，有表达
用这个最初的质粒去扩增，大提得到的质粒，再去做转染，就怎么也看不到重组蛋白的
表达了
为什么为什么？ |
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C**S
发帖数: 522 | 22 谢谢。我是担心这样筛，会不会像pcDNA质粒一样，出现好多假阳性的克隆。
刚刚想起来retro和lenti都是RNA病毒，我前面几贴的显得很白痴，让大家笑话了。
transfection. |
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b***2
发帖数: 348 | 23 HeLa很好转的。会不会是质粒的问题。我用2000转PCDNA一点问题都没有。 |
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p*******r
发帖数: 156 | 24 最近本人在将一个6000-8000bp连接到pcDNA 3.1（+）(5400bp)中去, 使用普通的连接
酶至今都没有连接进去，真心向各位大虾请教，大家通常如何使用什么神奇的连接方法
和kit,thanks a lot |
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b***2
发帖数: 348 | 25 如果是类似于pcdna的系统的话，G418筛出来的克隆大部分是假的。我用荧光蛋白试过
。能有10%的真阳性就不错了
-阳 |
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s********x
发帖数: 472 | 26 一些virus的dna 序列是帮助质粒入核的. 但是有没有人知道是那段序列？比如常见的
pcdna系列vector. |
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S**********e
发帖数: 1789 | 27 转染效率的确是个问题。这个细胞对质粒转染效率是没问题的，但miRNA的确不知道。
看样子要搞一个对照看看了。
载体表达miRNA没问题，这个我知道，我也买了一个表达miRNA的质粒，但pcDNA表达
miRNA不知道是否正确。 表达蛋白的载体也可以表达miRNA?
tricky |
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h*****n
发帖数: 47 | 28 请教克隆大牛和电生理大牛，现在要研究一种叫hERG的钾通道在 HEK293 细胞上的表达
，把这个hERG转到哪种vector 上表达强呢？为了以后做电生理记录的电流可以大点。
除了pcDNA3，还有在HEK上表达好的载体吗？pcDNA 的话，是3.1比3.0更好吗？大牛见
笑，穷人，所有家当16个包子奉上！ |
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d*****r
发帖数: 45 | 29 不是大牛
pcDNA 完全可以，你也可以试试vectors with CAG promoter，理论上表达更强.
另外，你可能要先make sure HEK293 里有没有内源性的potassium currents ， 会不
会干扰hERG currents. |
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z*********s
发帖数: 38 | 30 我的问题可能没有问清楚，我想问的是对于pCDNA3.1质粒，polyA是加在质粒对应的哪
个位置的？ |
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S******y
发帖数: 2 | 31 after every eukaryotic gene cds. So in this case, after mcs and neomycin. |
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T*****e
发帖数: 247 | 32 从manual里面copy过来的：
Bovine growth hormone (BGH) polyadenylation signal
Efficient transcription termination and polyadenylation of mRNA (Goodwin and
Rottman, 1992)
这应该是3'UTR吧，正常就是3'UTR后面
肯定在neomycin和它的SV40启动子前面，也跟f1 ori没啥关系
所以就在bgh signal的后面 |
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n**u
发帖数: 87 | 33 This is polyA you are asking.....
：从manual里面copy过来的：
：Bovine growth hormone (BGH) polyadenylation signal |
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发帖数: 1 | 34 其实就是最基本的pcDNA3.1 plasmid。
以前他做实验都用没有质粒的做对照，有一次labmeeting我show出来的用pcDNA做对照
然后他就一直问我要。一开始我就给了100ug，现在用完了又来问我要。关键是这东西
可以自己养细菌扩增纯化，东西不值钱，但是每次纯化我还需要时间。
怎么拒绝比较好些？ |
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