N****n
发帖数: 294 | 1 I have been having great difficulty doing subcloning. It used to be nothing
but now it is some kind of extreme work. I thought it was because my skill
deteriorated badly. Until I sequence a few clones. All the clones showed
that one of the two oligoes had lost half of the designed length. I thought
it was because the oligo wasn't pured and did a gel purification. To my
surprise, that particular oligo ran at the posistion corresponding to the
short size length compeletly. On the other hand, the ... 阅读全帖 |
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y****6
发帖数: 196 | 2 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azide modified oligo 反应
。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1 |
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y****6
发帖数: 196 | 3 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azimde modified oligo 反
应。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1 |
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e******6
发帖数: 6 | 4 Job Description
Cooperation Introduction
GenScript is a contract research organization (CRO) specialized in
biological research and drug discovery services. Ever since its inception in
2002, GenScript has experienced rapid, constant, and organic growth. Now
GenScript has become a leading biology contract research organization (CRO)
in the world, with a global operating team of over 900 dedicated scientists,
staffs.
Headquartered in Piscataway, New Jersey, GenScript has become a leading
Biology C... 阅读全帖 |
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b******k
发帖数: 1874 | 5 for this topic, many ppl replied. I have compiled some of them here. (btw, s
ome of them are better than the one marked). while majority of ppl suggest t
o add Pi tto oligo 3' end by TNK, I don't know why. Anyone could help give r
elated mechanisms? Thanks a lot.
???: smartkevin (Biofuels), ??: Biology
? ?: Re: ????:?????30bp?DNA fragment ???vector?
???: BBS ????? (Tue May 18 04:01:41 2010, ??)
??oligo?????????????,???????????
??????protocol,??????:
1. oligos?TE or H2O??,??100 uM;
2. ???????,37 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 有，叫splinted ligation。
因为T4 DNA ligase的功能是特异性修复双链DNA上的nick。所以需要设计一个splint
oligo，和你需要ligate的两个oligo的两端各自互补。像这样：
图里显示的是连接RNA，不过DNA也是一样的。
这个protocol在这里：
http://www.megaupload.com/?d=QT50D23R
[7] Joining of RNAs by splinted ligation
Melissa J. Moore and Charles C. Query
Methods in Enzymology
Volume 317, 2000, Pages 109-123
RNA - Ligand Interactions, Part A |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 suppose I have a pool of oligos (say 100 unique sequences), each
15-20base long, biotinylated on 5' end. what's the best way
to sequence them?
I guess if w/o biotin, I can probably make ds using random primer, and then
clone into sequence vector. can I do sth similar with biotinylated oligos?
thx!! |
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N****n
发帖数: 294 | 8 It was only 32 nt. Based on sequencing result, it was short by 15nt. I tried
to purify the oligo on PAGE. It was short as well when compared to similar
length oligo. So I am sure it was short.
I have used idt for many years. If there were problem, I normally order news
one thinking my design had problem until I did sequencing and gel
purification. |
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w******e
发帖数: 1187 | 9 最简单的biotinylated oligo往avidin NP上conjugate，yield巨低。。。
请教biotin-avidin interaction 会很挑buffer/etc condition吗？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 我用的是pH 7.4的20mM Tris Acetate buffer，还含了140mM的NaCl和5mM KCl, 1mM
CaCl2, 1mM MgCl2
这个recipe应该是从这篇paper来的：Bock et al. Nature 1992. (355)564-6. 这篇
paper不是用biotin-streptavidin interaction，但是我们就用这个条件做好像没啥太
大问题，至少bind得貌似挺好。
你有没有做个positive control看看是不是你的nanoparticle或者labeled oligo本身
的问题啊？biotin-avidin的binding应该是不太挑条件的，要不然就不会应用那么广了
。 |
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y******8
发帖数: 1764 | 11 直接合成不是更好吗？
不太清楚你的oligo是什么性质的。加Biotin-T并不是很有效的反应，一般都还要再PCR
扩增。如果做imaging，要用多级反应放大信号。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 12 en dynal beads are at um level. maybe I should try that too...
I don't have much biotinylated oligo to begin with, so UV won't be accurate
for me... |
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w******e
发帖数: 1187 | 13 要ligate two short ss oligos （~80 base for one, 10-30 base for the other)，
有可能达到高效率吗（比如至少20％）？隐约记得可以用complementary sequence
作为guide来提高效率，不知有没有现成的protocol？请牛人指点。多谢！ |
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p*l
发帖数: 1359 | 15 第一次买，用IDT，一个多月了还没见oligo的影子。大家常用那些公司啊？ |
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m****M
发帖数: 360 | 16 有哪位做过抗体和DNA conjugate的？crosslinker是什么？最多能连多长的DNA/oligo/
primer （i.e.双链,单链都可以）。连后是怎么分离没有连上的DNA，要保持抗体仍然
具有结合抗原的能力。非常感谢 |
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s*********t
发帖数: 600 | 17 我需要合成一些5mC甲基化修饰的长DNA oligos。
长度在至少50 mer，甚至更长，定点的Cytosine被修饰成5mC。大概需要50－100 ug。
能否给推荐一家公司，价格便宜质量又好的。
非常感谢！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 18 naive question -- can MS distinguish two oligos with same base composition
but different sequence? I have little idea how MS works... |
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R****n
发帖数: 708 | 19 Maybe I am wrong. But I don't think that you can use MALDI-TOF for oligo
nucleotide sequencing. |
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o**4
发帖数: 35028 | 20 我用feng zhang实验室的网站设计的结果如下：
http://crispr.mit.edu/job/9989720016962422
all guides
scored by inverse likelihood of offtarget binding
mouse over for details ... hide legend
high quality guide
mid quality guide
low quality guide
score sequence
Guide #1 68 AGCTGTAGCATTTTCTAACT TGG
Guide #2 62 AGCTACAAACTTTAAGACAA AGG
Guide #1 44 TTACTTTCTGAAAATCATCT TGG
Guide #3 43 TTAAGCTTTCTATTGTTTGT CGG
Guide #5 40 TTTGCCTGAACAACTTAAAG AGG
Guide #4 31 CAGAAAGTAAAACTAAAAGT TGG... 阅读全帖 |
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o**4
发帖数: 35028 | 21 我用feng zhang实验室的网站设计的结果如下：
http://crispr.mit.edu/job/9989720016962422
all guides
scored by inverse likelihood of offtarget binding
mouse over for details ... hide legend
high quality guide
mid quality guide
low quality guide
score sequence
Guide #1 68 AGCTGTAGCATTTTCTAACT TGG
Guide #2 62 AGCTACAAACTTTAAGACAA AGG
Guide #1 44 TTACTTTCTGAAAATCATCT TGG
Guide #3 43 TTAAGCTTTCTATTGTTTGT CGG
Guide #5 40 TTTGCCTGAACAACTTAAAG AGG
Guide #4 31 CAGAAAGTAAAACTAAAAGT TGG... 阅读全帖 |
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f*****f
发帖数: 195 | 22 不用加，oligo 20bp两侧加上载体对应酶切位点，可以连接上就行。Feng Zhang
nature protocol也有介绍。 |
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m******o
发帖数: 8504 | 23 我就是用的这个
[在 flyskyf (flyskyf) 的大作中提到：]
：不用加，oligo 20bp两侧加上载体对应酶切位点，可以连接上就行。Feng Zhang
：nature protocol也有介绍。
：........... |
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s******n
发帖数: 47 | 24 请教有经验的大侠，哪家公司的RNA oligo synthesis比较便宜。看了一下IDT的，6.5
刀一个base （100nmol）。但我不需要这么多， 20nmol就够了。不知道有没有其他公
司会更便宜。
不甚感激！ |
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z*t
发帖数: 863 | 26 最近换地方，发现IDT的价格上涨，非常不爽。。。不知道大家有没有推荐的便宜好用
的oligo synthesis的公司？价格能到$0.1/bp的 |
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h**********r
发帖数: 671 | 27 没人回这个帖子？一直用Invitrogen的Value Oligos。价格是$3.75每个primer (5-40
bp),要求25个primer以上。 |
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发帖数: 1 | 28 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 我好奇的去看了一眼，刚刚有一个人出来说他做出来了。他的做法是用激酶来磷酸
化那个oligo，而不是从厂家订磷酸化的oligo。因为这个5'-end 磷酸化很关键，没有
磷酸化的Oligo不能被NgAgo识别。从理论上来说，如果oligo 的磷酸化不完全的话，就
有可能出现那些没有磷酸化的oligo和磷酸化的oligo 互相竞争结合基因上的位点而降
低酶的效率。所以弄不好这个磷酸化就是其中的技术要点。
貌似这个是目前第一个跳出来说重复出来了的人。静待更多的跟进报道。
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Jan Winter
5:34 PM (1 hour ago)
Hi guys,
Just had a couple of tests with ngago from addgene and custom Oligos, so I
did not try to reproduce the paper.
And in my hands I see an effect that is slightly ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 30 所谓做出来了 是怎么做出来的？
测序了吗？看到切割了吗？
重复的fig4？
[在 sunnyday (胖头鱼。按斤卖就赚了) 的大作中提到：]
:我好奇的去看了一眼，刚刚有一个人出来说他做出来了。他的做法是用激酶来磷酸
:化那个oligo，而不是从厂家订磷酸化的oligo。因为这个5'-end 磷酸化很关键，
没有
:磷酸化的Oligo不能被NgAgo识别。从理论上来说，如果oligo 的磷酸化不完全的话，
就有可能出现那些没有磷酸化的oligo和磷酸化的oligo 互相竞争结合基因上的位点而降
:低酶的效率。所以弄不好这个磷酸化就是其中的技术要点。
:貌似这个是目前第一个跳出来说重复出来了的人。静待更多的跟进报道。
:Jan Winter
:Hi guys,
:Just had a couple of tests with ngago from addgene and custom Oligos, so I
did not try to reproduce the paper.
:And in my hands I see an effect that is slight... 阅读全帖 |
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s****2
发帖数: 4569 | 31 Director of DNA synthesis
Position Summary
We are seeking for a highly motivated scientist as a director of DNA
synthesis unit, leading a DNA synthetic group to establish DNA synthesis
facility and develop high quality DNA synthesis service at Wuxi Apptec. The
successful candidate will be expected to have extensive experience with DNA/
RNA synthesize facilities, oligo purification technology and a variety of
DNA synthesis products.
Required Qualifications
PhD in Biology, Chemistry, B... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 5 | 32 我查阅了一些方法，有将氨基修饰的oligo（DNA）通过戊二醛偶联接到氨基修饰的玻璃
表面的，但是我用互补的带荧光的oligo杂交上去后发现对照实验（非互补的oligo）的
荧光也很强，无法判断氨基修饰的oligo是否接到玻璃表面了。
想了很多办法去消除非特异性吸附，也不太成功，不知道各位有没有做过这方面实验的
，或者采用过别的方法（例如SH修饰表面与acrylamide修饰oligo,或环氧基修饰表面与
氨基修饰oligo等），盼指教一二。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 33 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
我试过的一个protocol，非常简单好用：
1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
这个产物可以直接用于连接。 |
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a****a
发帖数: 3905 | 34 oligo microarray实际上不是print, 而是在solid surface上合成.
基本的原理是, 先将一个碱基固定上去,(当然, 是按照一定的pattern
固定大量的碱基在很小的一个区域内, 不过一个点只有一个), 然后通过
光化学反应合成oligo. 一次加入一个碱基, 每回光照的时候都通过
一个特定的mask, 所以有些点加入了这一碱基, 有些点没有.这样就
可以在一个chip上合成各种不同的oligo.
一般而言, 会由若干个不同的oligo代表一个gene, 有些是特异的,有些
是非特异的, 这样根据不同的hybirdization intensity就可以得出所
检测的DNA的量.
PCR类的, 从技术上讲要简单的多, 实际上就是把PCR产物通过极细的针尖
点在slide上, (就是一般的slide啦), 然后固化, 后处理. 一般而言, 在
2cm见方的区域内点上5000到6000个点是可行的.
Probe的标记一般是用荧光染料, Cy3-UTP和Cy5-UTP是最常用的. |
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n******d
发帖数: 680 | 36 合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
量加
长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点
章也 |
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a****o
发帖数: 1786 | 37 dePi ur oligo
order a 5'P oligo A w/ known sequence
ligate w/ RNA ligase
use reverse complement oligo of A to do primer extension to get double
strand DNA
clone into T-vector or blunt end vector |
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B******o
发帖数: 496 | 38 最近花了很多时间折腾RACE。无论是3'还是5'都是铩羽而归。
目前的情况是，3'RACE。 Clontech的kit提供的primer实际上就是Oligo dT加一段
specific的RACE primer。整个反应里就RT酶，total RNA，Oligo dT和dNTP。
cDNA产物用gene specific primer A + RACE primer没有任何条带出来。作为control
，用另一个gene specific的primer B和A配对却有条带。说明RT反应没有问题。可是RT
反应要进行，RACE primer conjugated oligo dT也要能work才行啊？
哪位能说说到底什么地方出问题？ 万分感谢 |
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b******n
发帖数: 4225 | 39 不是牛人，不过感兴趣看了一下
感觉方法没问题啊，你的图好像分析有问题
不要自己将oligo转成reverse complementary的形式，用原始序列
这是一个三片段链接，转座子，左边oligo linker，右边oligo linker连成一个环
转座子可能正向插入，也可能反向插入，
所以需要在转座子DR/IR用BamHI/XhoI切一下好进行PCR扩增
FusionA/B是pyrosequencing的adaptor,barcode是用来区分多个样品的标记 |
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x*****e
发帖数: 309 | 40 低丰度的gene用gene-specific oligo 作为反转录引物据说效果好，效率不高可能和
gene-specific oligo设计以及RT酶有关。RT 一般42度，而普通PCR引物设计时候的退
火温度远高于42度， 可能设计6-12bp左右的gene-specific oligo效果比较好；选对模
板二级结构不怎么敏感的RT酶吧，能反转录的cDNA越大越好，6kb以上的应该就够了。 |
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发帖数: 1 | 41 确实并没有排除假阳性。他是用GFP的表达来显示表达GFP的那段基因组序列有没有被破
坏掉，那么就有两种可能性，第一是GFP的基因组片段被破坏，第二表达GFP的mRNA被破
坏，第三种是GFP基因组序列被修饰沉默（这个我在hiPS细胞上发现过，很多时候如果
GFP自带promoter的话，这个promoter有被随机沉默的可能性。另外即使是把GFPknock-
in到某个蛋白的内部，也是有可能被沉默掉，这个我听一个中科院的人讲过，机理不清
楚）。对于第二种可能性，因为他是用磷酸化酶处理oligo，很有可能这个处理不完全
，还含有大量未被磷酸化的oligo，他的对照应该是那种没有通过磷酸化的oligo，确保
不是因为RNA破坏了mRNA。还是等他们的基因组测序结果吧 |
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j****n
发帖数: 3370 | 42 和你平时做的没啥区别 流程是一摸一样的
就是gRNA是合成oligo pool
克隆的时候要保证效率够高
最好能cover 100x library
我们都是自己建库 没啥困难的
合成oligo不贵 我们用的90k oligo大概4-5k刀的样子
至于有没提供建库服务以及收费就不清楚了 |
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r*f
发帖数: 39119 | 44
偶这里估计比你那里还凉快吧，也就这几天才比较春天。
偶得s1用完了，现在还在用哪个oligo 25。我打算外面末一层sunblock，
反正不怎么化妆的，呵呵，看看行不行。
等这个oligo 25用完了，再去买个带spf的面霜。 |
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s********n
发帖数: 650 | 45 3. 化妆品权威选购指南
日本的化妆品市场非常成熟,日本mm早就练就一身海里捞针的本事,不一定昂贵,不
一定
是名牌,只用质量最好的,最适合自己的.
介绍一个今年的最爱护肤品排行,来自一本读者群在25岁左右的美容杂志,
排行内大多数产品国内都能见到,希望能给大家做个参考.
3.1 卸妆清洁：
第一位: dhc deep cleansing oil
第二位: 资生堂tiss deep off oil
第三位: kose 清肌晶cleansing oil
第四位: 植村秀 high performance balancing oil
第五位: clarins娇韵诗 cleansing milk
卸妆油有卓越的卸妆效果，对皮肤的负担也小，所以在卸妆清洁类中卸妆油依旧是主
流。
第一位是dhc公司的看家产品。油质很轻，带着淡淡的橄榄香，卸彩妆效果当然不
用说
，去黑头的效果也不错。而且很容易冲洗干净，我自
己就在用，用她之后不需要再用泡沫再洗,这一点让人相当满意。
第二位是资生堂的产品，用过之后，感觉毛孔小了些，给人彻底清洁的满足感。而且
价格公道，150毫升合人民币65元左右。
高丝的清肌晶... 阅读全帖 |
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a****a
发帖数: 3905 | 46 Stanford是这种技术的发源地, 实际上, 很多分析软件都是从Stanford出来的.
两种方法基本原理相似, 但是数据的分析不同.
PCR microarray一般同时用两个probe, 就是所谓的two color hybrid, 直接比较
两种荧光染料的强度, 就可以知道两种probe量的变化差异.
oligo 类的分析要复杂, 因为多个oligo代表一个基因, 所以要综合这几个spot
的intensity来判断.
道理简单, 但是由于PCR product printing的时候可能的影响因素很多, 所以
数据的分析依然是不太成熟的. |
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a****a
发帖数: 3905 | 47 技术发展很难预计的。
不知道你这里microarray和DNA chip有什么区别，指PCR的print
和oligo Array之间的差别么？如果是这样的话
microarray较affy chip存在的理由，是PCR product的print并不需要
知道完全的序列，而chip制造的基础在于你需要知道sequence,构建
oligo库，制造芯片。
从数据的角度而言，两者的数据分析都存在着极大的variance, 所以实际
上，现在能利用的数据只是得到的数据的冰山一角而已。看过pat brown的
paper么？不做repeat, 做上上千种条件。对于每一张slide, 数据实际上
没有意义的，但是当把上千张slide cluster到一块的时候，这些数据就变
得有意义了。
从零一个角度而言，从现有的分析中，我们只能关注那些极端express或者
repress的基因，就如你列的那些文章，作为一般实验技术的前导与辅助，
去研究某个具体的基因，具体的条件而已，但这只是microarray/chip运用
的一个方面而已
如何能提高技术的精确度，如何能运用大量不是特别极端的数据，这是 |
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z***h
发帖数: 998 | 49 你这个实验的第一步是希望oilgo只结合到lamda的两个粘性末端的一个
所以首先要避免的是lamda DNA的环装自连,所以lamda DNA首先要5'去磷酸化
然后用摩尔浓度较少的oligo去结合lamda末端,理想的状况是只结合其中一个末端
生物反应都是一个平衡过程,所以不可能出现oligo全部被结合的情况
在做完第一步连接反应之后,需要过分子筛滤去剩余的小分子
可以用这个公司的产品:
http://198.173.130.129/princeton/prinsep.nsf/html/products-centri-spin40
或者干脆做胶回收,只截取一个lamda长度的条带
然后第二部必须先做5'磷酸化,使分子间连接成为可能
然后跑胶拿到2个lamda长度的片段,但其中仍然只有一部分是你所需要的两端不同
标记的DNA,至于怎么鉴别,恕我不知了 |
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f********g
发帖数: 6 | 50 You don't need kinase if the vector/fragment the linker is ligated to has 5'p
on its end, which usually is the case. When you use restriction enzyme to
generate the new end from the linker, you also generate the 5'p on the end. I
think people who are using kinase are ligating oligos to de-phosphorylated
vector etc, in that case you need to add 5'p to your annealed oligos.
我以前anneal以后直接用来做连接，从来没有问题。而且anneal过程中我没有加过kinase |
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