h******y
发帖数: 351 | 1 MEF在20%氧气的培养条件下，很快（6-8个passage以后）就会停止生长。 这是因为MEF
对reactive oxygen species很敏感，由此引起的DNA damage激活p53以及其他信号（正
常生长因子和matrix缺失等）激活p16-Rb通路，引起senescence。你应该问一下他们给
你的MEF的passage，最好要到分离后第1或第2代的细胞，这样你还能用几代。
但是如果你把这些停止生长的细胞保留着（不要传代），过几个星期你会发现细胞又长
起来了，而且越长越好，这就是自发immortalized的细胞。很多MEF细胞系就是这样建立
起来的，例如著名的3T3系列。但是我不建议你用这些immortalized的MEF做实验，因为
上述ROS引起DNA damage的原因，这些自发immortalized的MEF已经产生太多基因变异（
因为需要bypass p53和p16-Rb两个重要通路的抑制），即使你看到表型的差异，也很难
说是你的gene KO的结果。
如果确实需要长久使用MEF，一是拿到老鼠，分离新鲜的MEF做实验。二是利用低氧（3-
5%）条件培养MEF... 阅读全帖 |
|
h******y
发帖数: 351 | 2 你说的比较温和是指什么？
来源于很多组织的人的fibroblast可以通过overexpress hTERT得到immortalization，
这是由于人的fibroblast在体外培养条件下的senescence多是由于端粒渐行缩短而导致
的（telomere-dependent replicative senescence）。与人的fibroblast不同，体外
培养中MEF的senescence并不是由于端粒缩短引起的,而是由于如前所述的过氧基团累积
oxidative stress induced DNA damage。研究表明senescence的MEF的端粒还很长，而
且MEF中有较高的mTERT表达，所以过表达mTERT并不能有效immortalize MEF。因为要抑
制p53和Rb通路，所以表达异源的SV40 T和HPV16 E6/E7都可以immortalize MEF。当然
这样得到的细胞株，由于这些病毒蛋白的过量表达，基因组并不稳定，长久培养会出现
嬗变。
3T3办法引起的自发immortalization实际上主要是由于自发的p53通路抑制（p53 loss... 阅读全帖 |
|
h******y
发帖数: 351 | 3 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
中不需要加b-ME.
了。 |
|
l****j
发帖数: 70 | 4 我确实想要长久使用MEF,
请问新鲜的MEF是指在20% 氧气吗？可以最多传几代？
如果是低氧能传到第几代呢？能一直养下去吗？
如果确实需要长久使用MEF，一是拿到老鼠，分离新鲜的MEF做实验。二是利用低氧（3-
5%）条件培养MEF。 |
|
h******y
发帖数: 351 | 5 不明白你为什么一定要用immortalized的MEF。因为上述MEF需要克服p53和Rb两个通路
对细胞分裂的共同抑制，MEF需要产生很多基因突变，所以自发immortalization的几率
很小。如何你想同时获得immortalized的野生型和KO的MEF，你的两株细胞的各自
immortalization是两个独立的事件，即使你能获得immortalized的细胞株，他们之间
也已经不能作为参照了。 |
|
l****j
发帖数: 70 | 6 我是分别从wt和ko mouse embryo 中分离的MEF cell,不是用来做feeder，
敲除的基因能在 ER stress，apoptosis，autophagy 中起作用，
我有overexpression的细胞系，但还想用MEF cell 做类似的实验，其他人发表的文章
用过MEF cell，我也想试试。 |
|
h******y
发帖数: 351 | 7 If you culture MEF under 20% oxygen, then it is the best to use cells before
passage 6 (please keep in mind that the best seeding density of MEF is
about 5000/cm2.)
If you culture the MEFs under 3-5% Oxygen, you can go up to 50 passages.
Huge difference as you can see.
3-
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
|
h******y
发帖数: 351 | 8 对于上皮细胞，最近有人发现利用feeder cells（主要是MEFs）和ROCK Inhibitor可以
有效immortalize。但是对于MEFs，光用ROCK Inhibitor可能不行。除了常用的SV40T和
HPV16 E6/E7，也可以用其他oncogene，例如c-Myc，Ras，BmiI，CDK4等等。因为MEFs
是原代细胞，转染效率很低，通常大家都用lenti，retro，或者电转。 |
|
|
a*****n
发帖数: 2835 | 9 我刚从别的实验室要过来的，形态有点不是很像MEFs，同时要了TSC2 P53 double KO
MEFs，P53 KO MEFs用来做对照的。两种细胞形态差别太大，不知道是不是有问题。 |
|
l**********n
发帖数: 240 | 10 最近开始养mouse干细胞，从EMD Millipore 买了几次MEF， 怀疑他家的MEF有细菌污染
，因为总能看到漂浮移动的黑点在培养基中。
不知版上的朋友有没有做同样实验的，能否推荐一个好的公司，能买到质量比较好的
MEF。
多谢！ |
|
r******k
发帖数: 446 | 11 不不 我的意思是 我有俩mes cell。 一个我已经脱MEF培养了 一个还在MEF上培养。
我其实想问问这两个会不会在signaling上有啥改变？ 如果我没有我就直接脱MEF了。 |
|
发帖数: 1 | 12 要在MEFs细胞里用lentivirus表达基因。看到有文章说CMV启动子在MEFs细胞中会被沉
默掉，效率不高。请问各位老师有相关经验吗？我是否应该选择用EF1a启动子在MEFs细
胞里表达基因更好？ |
|
a****l
发帖数: 125 | 13 诸位大侠可知到用什麽方发transfect siRNA 到 MEFs cells 里面吗? 要 transient
的transfection 就可以. 貌似MEFs 不太好转染的说. Lipofectamin 2000 可以吗?
谢先 |
|
g******r
发帖数: 139 | 14 我曾经试图在MEF里knockdown一个人细胞里很容易作到的基因，结果不管用电转还是
Invitrogen的2000或者RNAiMAX都不行。后来我投稿的杂志编辑也承认这是很难的 （
knockdown in MEFs is often challenging）。 |
|
f*******e
发帖数: 354 | 15 方法 2+6 失败
2+2+2+2 失败
MDI 失败
MDI+troglitazone 失败
MDI+troglitazone+BMP4 失败
MEF C57 （backcrossed 10g+）
同时的KO MEF 分化的很凶猛
到底是什么问题，头大，有没有人遇到过类似的情况
WT/Het(6+3)共九株原代 都不行
KO 每株都行
aaaa，谁来救救我！！！ |
|
E**********1
发帖数: 73 | 16 请问一下各位都知道哪些方法可以提高胞内Ca2+浓度?我用的是MEFs.
我现在只知道一种是用50mM的KCl加到culture medium里面，induce depolarization,
然后使voltage-dependent calcium channel打开，使胞内Ca2+升高。但是有一点不确
定的是MEFs是否有voltage-dependent calcium channel。
求各位指点，在此先谢过了！~ |
|
n***w
发帖数: 2405 | 17 No. You misunderstood the paper. ATP is used to activate the adenosine
receptor.
The largest calcium store inside the cell is endoplasmic reticulum, which
can release a large amount of calcium upon IP3-R is activated.
Mitochondria is critical in maintaining calcium homeostasis and will take up
calcium if there is calcium overload.
You can transfect your MEFs with cytoplasmic aequorin (you can search on
this to get a better idea), which is widely used as a intracellular calcium
indicator.
You can... 阅读全帖 |
|
C****b
发帖数: 90 | 18 We have a RNAi screener who spent around 3 months to optimize the MEF
transfection condition. Finally she got 70~80% transfection efficiency.
Summary
Reagent: DharmaFECT
Cell: 30% confluent MEF instead of 70~80% confluent
Good luck! |
|
C****b
发帖数: 90 | 19 We have a RNAi screener who spent around 3 months to optimize the MEF
transfection condition. Finally she got 70~80% transfection efficiency.
Summary
Reagent: DharmaFECT
Cell: 30% confluent MEF instead of 70~80% confluent
Good luck! |
|
l****j
发帖数: 70 | 20 MEF cell，第一代长的很好，
第二代就长的乱七八糟了，形态都不太规则，有大有小，还有多核的，有的都不像
fibroblast了
我完全照着protocol做的，medium里都加mercaptoethanol了
Current Protocols in Molecular Biology (2005) 28.1.1-28.1.8
UNIT 28.1
Preparation, Culture, and Immortalization of Mouse Embryonic Fibroblasts
有人有类似情况吗？
MEF cell怎么能长得好？ |
|
u**********d
发帖数: 573 | 21 听起来好生动啊，ROS这么牛，MEF这么菜
MEF
建立 |
|
|
x*********i
发帖数: 28 | 23 根据MEF分离的protocol, 要将胚胎的头和肝脏（红色组织）去除。
去头比较容易，但是肝脏不容易去除干净。
请问，肝脏去除不干净有什么影响吗？ 里面有些什么细胞会污染MEF？ |
|
|
|
|
C******r
发帖数: 790 | 27 哪种方法好转染？磷酸钙，PEI，Fugin6, Lipo2000, Lipo-plus？
或者都不容易转染？就只好硬着头皮再一个一个往lenti-vector里装。MEF是否比较容易
被lenti感染？
Thanks for answer. |
|
|
s*****g
发帖数: 7857 | 29 如果再用抗生素筛选,可以保持长久吗?(没试过MEF) |
|
g****0
发帖数: 425 | 30 fresh isolated mef from the same litter? |
|
E**********1
发帖数: 73 | 31
Thanks a lot!
I am wondering whether it is a general method, which means this method also
works on MEFs.
And I need more details about the method you mentioned, so could you give me
a link of the protocol or a paper where the method has been used. |
|
|
n***w
发帖数: 2405 | 33 I do not know much about Fura2-AM. I read papers that use this dye
in neurons but not in MEFs.
Based on your objective, I do think probably using a dye may be better than
aequorin. But the experimental conditions need to be carefully taken care of
since Fura2-AM imaging may be affected by many variables.
Good luck.
about |
|
a****l
发帖数: 125 | 34 请问诸位大侠如何immortalize MEFs? 本人试了一次3T3 protocol (3x105 cells 每3
天传一次）. 传了几代后细胞就不长了。不知怎么回事。有人试过large T antigen 吗？
多谢 |
|
x**y
发帖数: 46 | 35 请教有经验的大侠：
想在MEF细胞里，做转染。哪个试剂效率高啊？另外，用病毒转染，效率能有多少？ |
|
v*********d
发帖数: 382 | 36 要高效肯定是病毒，效率就看titer了，高titer下，90％ 没问题
要是50％－70％ 左右可以的话，可以试试lonza （Amaxa）或者invitrogen 的 neon
transfection system， 都是电＋化学的。 另外，MEF passage越多，效率越差 |
|
x**y
发帖数: 46 | 37 请教有经验的大侠：
想在MEF细胞里，做转染。哪个试剂效率高啊？另外，用病毒转染，效率能有多少？ |
|
v*********d
发帖数: 382 | 38 要高效肯定是病毒，效率就看titer了，高titer下，90％ 没问题
要是50％－70％ 左右可以的话，可以试试lonza （Amaxa）或者invitrogen 的 neon
transfection system， 都是电＋化学的。 另外，MEF passage越多，效率越差 |
|
s******o
发帖数: 187 | 39 I could not find the right lentiviral cloning vector that carries the SV40
large antigen. The ones on market are mostly in retrovirus.
I want a lentiviral vector to package SV40 lentivirus and then to
immortalize MEF cells.
anybody used lentiviral vector with SV40 large antigen? |
|
i*********0
发帖数: 915 | 40 最近做一个实验，用E14.5和E13.5时期isolated 的MEF （primary）来做实验，我发现
用4-OHT做gene inducible deletion5天，然后wash out 4-OHT以后，E14.5的mutant
细胞相对E14.5的control cell line proliferation降低，但是E13,5 的mutant cell
相对control cell line的proliferation居然升高了 （我每个时期的细胞系都有2个
control 2个mutant），一头雾水呀。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 41 RE:
孵蛋的 学弟/妹 giantbird05
温故下
http://www.mitbbs.com/article_t1/Biology/31657283_0_1.html
2nd floor
就知道新的
//www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell
-Culture/Transfection/Transfection___Selection-Misc/Neon-Transfection-System
/Neon-Protocols-Cell-Line-Data.html
这一答案啦
发信人: giantbird05 (大鸟), 信区: Biology
标 题: Re: 用什么办法能提高fibroblast 和MEF转染效率呢，
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jun 27 14:34:56 2012, 美东)
can you give me a neon protocol about these kind cells?
thanks.
30% |
|
e**r
发帖数: 1144 | 42 相差下看本来以为是污染了
取了一些培养基在高分辨物镜下看发现是针状的晶体
有人遇到过这种情况吗 ？
另外问一下，养MEF必须要加非必需氨基酸吗？
我只用了DMEM+FBS |
|
s******y
发帖数: 28562 | 43 MEF 非常好养，DMEM +FBS + antibiotics 足够了。
针状晶体？ 这个我还没有见过，是不是你们的培养箱的湿度不够，所以培养液蒸发了？
或者是在瓶子外面的盐沉淀？ |
|
m***g
发帖数: 197 | 44 我也正好有各相关的问题，一直困扰着。
问别的试验室要了一对MEF （wt和ko的），我想immortalize它，因为以后想经常用到
。我就打算一直传。
问题是，那个细胞长的特别慢，有的细胞拉伸的特别长，而且经常有死细胞悬浮。我只
好2天换一次DMEM（+FBS）。因为细胞数目越养越少，现在从要来之后从一个大flask传
到小flask，细胞密度与日俱减，真担心再过几个星期就养死了！
有没有什么挽救的办法？谢谢。我就这么“不管不顾”的传，可以么？需要额外添加的
什么东西能让细胞长的happy点么？ |
|
a****c
发帖数: 339 | 45 我用primary MEF,理论上只用passage 5之前的，根据实际情况有时候p6也能用，有时
候p3看着就完了。
有些实验室用T-antigen 做immortalization。不过我们老板死活不让用，非常郁闷。 |
|
m***g
发帖数: 197 | 46 非常感谢，
我用的是普通培养箱5% CO2.
目前不担心它对信号通路的影响，就是想得到可以经常稳定传代的细胞。因为是从费劲
要到这个细胞。所以，只能自己immortalize了
MEF
建立 |
|
h******y
发帖数: 351 | 47 sv40 T will inhibit p53, so it can be used to immortalize MEF
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
|
h******y
发帖数: 351 | 48 What do you want to do with the MEFs? Can you elaborate more
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
|
m***g
发帖数: 197 | 49 是这样的，要看一个酶的有和无，对他下游蛋白功能的影响。
不想用knockdown，因为这个酶很强大，有一点残留都会起作用。
KO是最理想的了。
他们给我们的这一对MEF，都是长的慢，死的多。我们没有其他immortalize的经验和质
粒，只好用这个传代的方法。
如果我不断的传代，到底会完全死掉，还是会有重生进而稳定生长的机会？ |
|
l****j
发帖数: 70 | 50 低氧的环境下会不会对我要研究的蛋白质有影响？
MEF
建立 |
|
