g*********5
发帖数: 2533 | 1 can you give me a neon protocol about these kind cells?
thanks.
30% |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 2 shi jie hao.
Cell
System |
|
d******u
发帖数: 178 | 3 有个法国的kit叫DreamFect，试过，还不错。具体能好到什么程度忘了。扫瑞。 |
|
|
|
|
e**r
发帖数: 1144 | 7 同样的培养箱里其他细胞就没问题
有一批Hela用的是一样的培养基，没有这种现象
了？ |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 9 正常，因为有些细胞出现了分裂障碍。
多分几代，分到大概7~8代的时候，那些乱七八糟的细胞就因为不能正常分裂而死光了。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 10 恩，你这个补充的很好，我不知道楼主分离那个是想干什么用的，如果是
用来进行immortalization，可以不管不顾地继续传代，传到下面就出现
形态正常的细胞了。但是如果是作为feeder 的话，只要功能在那里，形态
无所谓的。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 11 印象里会小鼠细胞会自发delete某一段chromosome, 然后immortalize。
记得就小鼠这样。human啥的可能要bypass两个通路，所以很少 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 12 非要用immortalized细胞么？你把一到2代的细胞冻起来，慢慢用不行么？ |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 14 你说的这些道理大家都明白，但是没有任何一个实验系统是完美的。
对于用immortalized细胞系做的实验，关键就是要做rescue实验进行对照，
在此前提下（有正确对照）做出来的结果还是能够得到认可的，很多文章
就是这么发表的。
其他方法，包括RNA knockdown, or molecular inhibitors, 都各有各的缺陷，
并不一定就比这个好。所以比较严谨的文章会同时用几种方法来重复
一些关键试验。 |
|
w***a
发帖数: 1053 | 15 我见过有人加一些生长因子
长的很好
就是那些东西都比较贵 |
|
h******y
发帖数: 351 | 16 Good point.
This is exactly right.
LZ need to think about other experiments that can corroborate any findings
from this paired immortalization experiment.
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
|
|
l****j
发帖数: 70 | 18 我follow的protocol说，b-ME 是为了创造一个还原条件，防止细胞分化。 |
|
l****j
发帖数: 70 | 19 我找的protocol上用的是0.25% trypsin在 4C overnight让trypsin完全浸入组织,然后
在 37C 30min 消化分离第一代，之后传代都用0.05% trypsin，但消化很困难，所以我
用了0.1%的trypsin,这样是会过度消化吗？
will |
|
s******y
发帖数: 28562 | 20 谢谢！我的合作者就是用的你贴的3T3方法，但是他们没有弄出来。
我以前也用过3T3方法但是那个是野生型，很容易诱导的。
现在这个KO, 说不定就是如你所言和p53和Rb通路有间接关系，
我为了保险，想用其他方法来诱导，不知道除了用病毒，还有什么其他法子么？
比方说加个什么什么化学品之类的？
如果用病毒的话，是否要用lenti or retro vector? |
|
g****0
发帖数: 425 | 21 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
-6盘10cm板，有何不妥吗？ |
|
h******y
发帖数: 351 | 22 一个embyro出3-6个10cm的板？厉害，下次用你的办法试试。
张3 |
|
g****0
发帖数: 425 | 23 先切碎，再泡。都要冰凉的。过夜还有一个好处就是可以先拿到genotyping结果。
你试试，然后对比一下，看MEFcell有何不同。 |
|
y***y
发帖数: 709 | 24 这个太强大了！
比我的产量高出4-6倍。
张3 |
|
|
|
a******7
发帖数: 7936 | 27 是啊，培养液中为什么加b-ME啊，这玩意不是做western的时候用来保持蛋白完整性的
么？跟二硫键有关 |
|
|
g*********5
发帖数: 2533 | 29 thanks, how much about this? |
|
h******y
发帖数: 351 | 30 I am not sure how much we paid for this model. You may need to get a quote
from the manufacturer or distributor. |
|
s******n
发帖数: 233 | 31 要了几个MEFs细胞系，retrovirus感染，有的感染率很高，有的压根不能感染（但
lentivirus 可感染），是细胞膜有些受体有变化吗？怎么解决？谢谢各位大侠！ |
|
t**l
发帖数: 109 | 32 如果给普通的细胞over express HSP, 比如MEF cell 来一个HSP overexpression, 会
发生什么呢？ |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 33 Re LZ:
try Stem Cell line: H9 hESCs
cited from
Das B. et al. (2012)
HIF-2a Suppresses p53 to Enhance the Stemness and Regenerative
Potential of Human Embryonic Stem Cells.
Stem Cells. 30: 1685-95.
>
hESC Culture and Induction of Hypoxia
Due permissions were obtained to culture hESCs both at Department
of Medicine, Stanford University (Stem Cell Research
Oversight protocol #285, director: BD) and at Department of
Laboratory Medicine and Pathobiology, Hospital for Sick Children.
BGO1 and H9 hESCs... 阅读全帖 |
|
f*****f
发帖数: 195 | 34 问一个要老鼠的问题？
找人要transgenic或knockout mouse 的话，对方一般是给ES细胞还是成体老鼠？
另，我自己用不到成体鼠，只需要MEF细胞，这样一般做老鼠的都有？对此不了解，多
谢。 |
|
w*e
发帖数: 740 | 35 做老鼠的lab不一定都做mef
不过，美国境内，一般都会给你成体老鼠，简单点。 |
|
|
i*********0
发帖数: 915 | 37 我想验证一下一个gene的KO能不能提高ips generation的效率，已有可以用OHT 做
induced deletion的MEFs，想问一下一个周期的ips generation一般多长？
谢谢！ |
|
i*********0
发帖数: 915 | 38 我想验证一下一个gene的KO能不能提高ips generation的效率，已有可以用OHT 做
induced deletion的MEFs，想问一下一个周期的ips generation一般多长？
谢谢！ |
|
r***e
发帖数: 2539 | 39 kidney细胞好像很好长，直接把mouse kidney切吧切吧绞碎了(和做MEF一样)，放在DME
M里，就能长很好，还能传好多代不死。 |
|
i*********0
发帖数: 915 | 40 不想从头来做virus的东西了，准备买公司的kit。用过的童靴能不能推荐一个。
另外，我从immortalized MEFs来做 （用的是shARF和3T3）的方法，这种细胞可行么？
真心求教，以前从来没有搞过这种。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 41 pls try Multiplex PCR by A, B and C three primers set (below figure that
X, Y, Z as A, B, C primers)
PMID 19936220
Generation and characterization of mice carrying a conditional allele of the
Wwox tumor suppressor gene. (2009).
PLoS One. 4: e7775.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19936220
or refer
Biology版 - 有没有可能出现假KNOCKOUT的情况?
hashuoy
2010-09-09 13:52:31
来自: 192.168.
1从公司订制的KO老鼠,带CRE基因,大半年折腾下来去掉CRE并拿到大量杂合子,按照公司
给的DATA SHEET, GENOTYPING双引物鉴定老鼠各基因表型正常,符合孟德尔遗传,但在对
培养的野生型和纯合子MEF细胞鉴定时,我发现虽... 阅读全帖 |
|
K**R
发帖数: 193 | 42 我最近做conditional KO 的老鼠， 首先用genotyping 选出 LOX+/+ 和Cre+ 的老鼠。
然后取出MEF培养。我不知道是抗体质量问题还是，其他原因。 被敲出的条带都很弱在
control 和 4hydrotamoxife driven。 我想问问有没有可能cre发生泄漏在genotyping
后？ 我想排除是不是抗体原因，谢谢大家！ |
|
j*******n
发帖数: 8 | 43 用一套人源和一套鼠源（MEFs）针对我的target gene的knock out cell lines做了
microarray，结果已出来，但我对microarray后期的分析统计没有什么概念。
我想请问，如果想在做分析时想用Venn Diagram或者之类的生物信息学手段将两组结果
整合在一起，会不会因为一个入源一个是鼠源而带来麻烦？
非常感谢！ |
|
c********e
发帖数: 598 | 44 Do you know how many overlapped genes expressed in mice and human MEF? |
|
s******r
发帖数: 1245 | 45 他这篇science的思路很简单，就是把yamanaka找到的那些因子全部用小分子代替，这
个东西很多实验室在做，之前已经找到了分别代替单个因子的小分子，但是合起来还是
要用到至少一个因子，差的就是临门一脚把这最后一个代替了，但大家都卡在这一步，
他们这篇文章里仔细摸出了条件，有点新东西是加了点小分子来调节甲基化。这篇文章
的意义主要是技术上的突破，就是实现了全部小分子reprogramming，证明了全小分子
这条路是可行的，这个对以后ips的应用非常有用，因为之前的所有方法多多少少都要
用到转基因，而一般认为只用小分子的话会更安全。当然他们做出来的东西到底有多大
的意义还需要更多验证，比如在其他种类的细胞特别是人的细胞上也要能重复出来，他
们文章里用的MEF本身是非常容易reprogramming的细胞，而他们做出来的效率虽然够用
了但是相当低的。
他五月份的那篇cell是一个跟其他实验室完全不同的新思路，那篇文章找到了新的因子
来reprogramming，意外的地方在于这些因子是定义胚层分化的因子，而通常人们认为
reprogramming是去分化的过程，两个相反的方向可以到达... 阅读全帖 |
|
b***2
发帖数: 348 | 46 我对本文谨慎乐观。丁胜几年前就筛出oct4加小分子的条件，这次是临门一脚把oct4也
换下了。但是另一方面，之前有报道说小鼠的oct4本来就是可取代的，而人的oct4是不
可取代的。所以在纯化学诱导人的方法出来之前，我持谨慎态度。nn【在 skycolor (
ss)的大作中提到：】n：他这篇science的思路很简单，就是把yamanaka找到的那些因
子全部用小分子代替，这n：个东西很多实验室在做，之前已经找到了分别代替单个因
子的小分子，但是合起来还是要用到至少一个因子，差的就是临门一脚把这最后一个代
替了，但大家都卡在这一步，他们这篇文章里仔细摸出了条件，有点新东西是加了点小
分子来调节甲基化。这篇文章的意义主要是技术上的突破，就是实现了全部小分子
reprogramming，证明了全小分子n：这条路是可行的，这个对以后ips的应用非常有用
，因为之前的所有方法多多少少都要n：用到转基因，而一般认为只用小分子的话会更
安全。当然他们做出来的东西到底有多大的意义还需要更多验证，比如在其他种类的细
胞特别是人的细胞上也要能重复出来，他们文章里用的MEF本身是非常容易
reprogr... 阅读全帖 |
|
z*t
发帖数: 863 | 47 那如果在一个已经分化的lineage里表达另一个lineage，会不会回到未分化状态？还是
两个lineage specifier要一起表达？
邓用的是MEF，把一个分化的细胞推回原始状态，但是如果我们看cacrinogenesis，很
多cacinogenesis都是由lineage defined progenitor cell发起的，互斥的lineage表
达就比较少 |
|
D****g
发帖数: 275 | 48 Don't worry, 99% of these cells are erythroblasts, and they are suspension
cells that can be washed away. |
|
C**S
发帖数: 522 | 49 MEF可以用E12.5天的胚胎的。你的胚胎是在12.5之前死亡？ |
|
m******h
发帖数: 38 | 50 是的。Embryo D10就完全吸收了。尝试过，拿不到MEF. |
|
