y*********u
发帖数: 183 | 1 常听到一个说法，就是如果loxp flanked的exon太大，就要小心只有一个loxp重组进去
，另一个loxp见鬼了的说法
但从另一方面说，同源重组应该是高度敏感的，loxp 30bp的不同很难想象会被
cellular machinery 识别为同源臂。
总而言之，多长的exon会bring in这个风险呢？
background是我要设计一个flank了300bp exon的loxp allelle
想在distal loxp那里设计一个 digetion site，被认为多此一举 |
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h********n
发帖数: 4079 | 2 请教一个Cre-LoxP 的问题.
I have a construct with a pair of LoxP sites, which I need to make mutation/
deletion so the LoxP sites do not work upon Cre. What is the minical
required mutation to let LoxP not work? And should I make mutation on both
LoxP site or just one?
谢谢谢谢. |
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h***9
发帖数: 662 | 3 发生recombination的时候，除了两个loxp之间的sequence会被recombine掉，loxp外端的序列也可能会受影响么？我在设计一个knock in mouse 的targeting vector,打算把loxp放在intron里面，但不知道loxp两边是否应该加一些random sequence.谢谢。 |
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y*********u
发帖数: 183 | 4 请问有哪些commercial available的质粒好用的？
有人用过如下这个质粒么？
Generation of a double-fluorescent double-selectable Cre/loxP indicator
vector for monitoring of intracellular recombination events.
Pfannkuche K, Wunderlich FT, Doss MX, Spitkovsky D, Reppel M, Sachinidis A,
Hescheler J.
Source
Institute for Neurophysiology, Robert Koch Str. 39, 50931 Cologne, Germany.
Abstract
Here we describe the generation of a double-fluorescent Cre/loxP indicator
system. This protocol involves (i) all cloning steps to generate ... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 5 我的意思是楼主不用担心loxp丢掉，至于能不能用是另外一回事
一听到自己不用做老鼠的就妒忌得不行……做construct打ES再等germline
transmission 最后等表达等phenotype多折腾人啊！！！
设计那么多酶切位点太夸张了，我觉得只要PCR sequence一下就可以了
800 bp那个floxed region他们设计酶切位点是precautions?最后有发现只有一个loxp
的克隆么？我看文献里报道了这种情况的都是2k floxed region才发生的。 如果800
bp能发生岂不是说明short arm只要800bp就能做targeting? (当然也可能，不过300bp
我觉得如果发生了可以发个genesis报告了)
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mo100159.
鼠女王能帮忙下载一个paper么？ |
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a*****s
发帖数: 131 | 6 Why do some of my Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP mice show YFP+ even without Cre
or anything else?? Does anyone have experience with these mice from Jax?
Thanks! |
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h********n
发帖数: 4079 | 7 this is leak, it happens in almost all LoxP-STOP-LoxP system. The stronger
of the promoter it has, the more leak they might have.
transcription machinery is not like 1 or 0, it has some 0.2 or 0.8 status.
Cre |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 Promoter本来就是一直开着的，不管是r26还是CAG还是CMV还是whatever being used
in this kind of system
这是transcription read through, 通常是因为loxp stop loxp 中的stop太弱
stronger |
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h********n
发帖数: 4079 | 9 再说说我的看法吧.
LoxP-stop-LoxP-geneX system will leak more or less. You did not find
protein expression only means the leakage is too low for your detection.
When a LSL-geneX mouse grows to adult and Cre recombinase is introduced by
adeno or lenti, the "newly" expressed geneX will not be recognized as a
foreign protein by mouse immune system.
and |
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h**********r
发帖数: 671 | 10 在给一个真菌做cre/lxop的knockout系统，想在一个质粒中装好cre和marker，两端是
loxp。cre克隆在真菌的诱导表达的启动子下游。cassette是这样子的：loxp-marker-
Promoter-cre-terminator-loxp。我是从AT克隆开始做的,pgem-t easy vector.问题是
最后一步怎么都装不上去。大小好像回到了最开始的pgem-t easy的载体上去了。初步
估计这个promoter在E. coli中也有表达，然后自己就把中间的那部分切下去了。试了
好几次，同样的情况。当然还没有sequence.请问大家遇到这种情况怎么办？ |
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B******w
发帖数: 1040 | 11 不好意思，可能问题有些愚蠢，只不过有些不太清楚。当两个loxp sites同向的话，导
致deletion （1）；如果两个loxp sites 互相朝向的话，导致inversion （2）；那如
果两个loxp sites相互反向的话 （3），会有什么重组发生吗？谢谢解疑 |
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h********n
发帖数: 4079 | 12 拿来的construct上正好有LoxP site, 可我要把Cre放上去(用在老鼠上), 所以要把
LoxP搞掉. |
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m******5
发帖数: 1383 | 13 我觉得既然没问题可以不用设，楼主的情况也许没交代清楚，兴许他的loxp在敏感区域
，能减少改变就得尽量减少？(比如5,UTR, splicing site) |
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D*a
发帖数: 6830 | 14 以后southern不用切么？
我也没造过老鼠，都是听周围造老鼠的说的。
我们用的floxed的老鼠两个loxp中间800bp左右，exon只有不到400，剩下的400是两边
各一段intron。两边都有几个酶切位点，不过我们的不在 5,UTR，在不在splicing
site就不知道了，从没有任何表型没有蛋白质降低来看应该是不在splicing site。
关键老鼠这玩意儿没见到最后跟cre交配的KO谁也不敢说没问题啊。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 15 汗。。。叫得太那啥了吧。。。
这篇在pubmed自己的数据库是free，你可以从pubmed过去，我email给你也行。
我们老鼠是不用做了，买cre再跟cre交配也要交一年啊。。。
loxp
300bp |
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r***e
发帖数: 2539 | 16 有没有文献报道过，用两个很远的loxp site，KO一个很大的DNA区段？
最大能做到多少？比如几个Mbp能行吗？
如果loxp不行，有什么新的技术吗？
谢谢了。 |
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D**F
发帖数: 54 | 17 最近用PCR鉴定 loxp小鼠
在flox区域两侧设计引物， 理论上WT 产物较短，floxed产物较长
但奇怪的是，要么只看到长的产物，要么只看到短的产物，从来没有见到过同时有长短
两条带
根据交配后代的结果显然那些只看到 长产物的小鼠中是有 loxp +/- 杂合体的
有人遇到过这种情况吗？
感觉是floxed allele在PCR中抑制了WT的扩增
但为什么会造成这种抑制实在想不明白 |
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w******f
发帖数: 37 | 18 想用AAV virus引进一个基因到brain里面（Cre dependent）
目前有genetic Cre driver mouse line.
现在有两种strategy可以做到：
1，promoter-loxP-STOP-loxP-Gene
2, promoter-Flex-Gene
请问有经验的大侠，哪种效率更好？
谢谢！ |
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w******f
发帖数: 37 | 19 谢谢！
另外， 我打算synthesize loxp-STOP-loxp cassette，但苦于找不到已经证明可行的
sequence（希望STOP是比较短的sequence）。有可推荐的么？谢谢 |
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s********9
发帖数: 132 | 20 第一次做cre-loxp，在target vector里，loxp在intron中的位置有什么讲究吗？我自
己能想到的是不能在intron的开头或者末尾，怕影响splicing？有什么明确的距离没有？
多谢指点。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 21 请教各位高人一个问题: conditional KO (LoxP) mice + Cre mice杂交产生KO mice
的时候,哪个是男/女有关系吗? 我好像有个印象, 应该要female Cre mice, 但不确定.
还有一个问题是, Cre对老鼠有其它影响吗?
哪位高人说说? 谢谢谢谢. |
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h********n
发帖数: 4079 | 22 谢谢上面各位的意见.
我要用beta-actin-Cre mice, 准备用female Cre mice (homo) 和 LoxP geen A (homo
)杂交, 生下来的小老鼠挑出完全应该是 Cre+/- A+/-, 然后兄弟姐妹交配, 看A-/-的
胚胎发育的情况. 已知A-/-胚胎致死.
现在的问题是, 在比较A-/- 和 A +/+ 胚胎的时候, 我能不能把不同的Cre genotype合
并比较?
谢谢. |
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o**i
发帖数: 1165 | 23 你要想不让cre 去binding 还是不去recombine
你不让cre去work 你干嘛放loxP上去
mutation/
both |
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h****g
发帖数: 439 | 25 比较小白。
一般把loxp放到某个基因某个exon的两侧，比如exon3. 在cre的作用下，exon3被cut。
但这个DNA是不是还是要转录成mrna，只是中间缺少了exon3？这个残缺的mrna还翻译成
蛋白吗？
确实很小白，大家不要笑:) |
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a*****s
发帖数: 131 | 26 没有Cre存在，LoxP位点有没有重组的几率？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 27 如题，loxa2和loxp有什么区别？似乎都可以用cre切？ |
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B******w
发帖数: 1040 | 29 谢谢，在figure2里面提到了inverted loxp，但是没有提到具体的朝向问题，是不是就
是说无所谓朝向，都会导致inverting？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 30
没明白你说的朝向是啥意思。。。loxp的方向是尾对尾，insert的方向调换了一下。跟
你上面说的2差不多。 |
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J********3
发帖数: 3151 | 32 这个文章有矛盾哈！
文章第5段有如下内容：“且慢，还不行。因为Rosa26启动子太弱了，即使是用EYFP单
基因，阳性跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里，谁知道是不是能
够看到EGFP信号呀。所以我们想可以放一个强启动子，于是我们选择了pCAG启动子，这
家伙不但动力强劲，而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就
开始做一个叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠。”
说的Rosa26启动子太弱了，所以做了pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠！
可是第6段如下：
“于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因（CD19）的cre小鼠交配，年前得到了一只
CD19Cre/Rosa-iDTRGFP小鼠。”
这一句显示并没有用到动力强劲pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠，明明是
用的启动子太弱的Rosa26-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP工具鼠，呵呵。
自相矛盾啊！ |
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C********4
发帖数: 308 | 33 一个条件性细胞剔除模式小鼠的诞生 (2013-02-22 18:10:22)转载▼
标签： talen 创业 大鼠基因敲除 基因敲除 杂谈 分类： 个人随笔
对于基因敲除（gene knockout）小鼠大家并不陌生，比如我们想要研究一个基因
在体内的功能，我们就可以把这个基因从小鼠体内敲除掉。而有的时候我们除了关心一
个基因的功能外，还想知道表达这个基因的细胞在体内是干嘛的。比如，我们想知道B
细胞是干什么的，胰岛细胞是干什么的？我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉（也叫
细胞剔除，cell depletion），一看不能产生新抗体了，或是胰岛素没了，血糖升高器
官衰竭了，我们就可以恍然大悟说：“你看，胰岛细胞是产生胰岛素的，B细胞是产生
抗体的”。然后就可以发文章到CNS（Cell, Nature, Science）了。当然这些都被别人
发现过了，是我们没有赶上好时代呀。
那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢？方法可能很多，但也真不多。这里我讲一
个非常简单的方法，就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素（Diphtheria toxin, 简
称DT）大... 阅读全帖 |
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s*******e
发帖数: 740 | 34 Thank you for carefully read my post.
你说的对，我只是将问题简化来说了，实际情况要复杂一些
我设计的vector包含3个loxp sites，前两个夹着一个exon，第二个和第三个夹
着一个neo基因，这是很常规的设计方法，整个insert region很大，有3k左右
我可以通过southern blot来检测homologous recombination，因为这个insert
引入了一个新的EcoRI site
我的确得到了homologous recombinated干细胞，并用它做了老鼠，但当我用这个老鼠
和Cre mouse杂交时，我怎么也看不到Cre－loxp recombination
仔细检查才发现第一个loxp site莫名其妙得丢了
如我前面叙述的，这个loxp site夹在两个NcoI site中间，它前面和后面很近
的DNA都进去了，就是这一段丢了 |
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a******p
发帖数: 414 | 35 一个可能是： 你的cre和loxp在同一条染色体上， 这种情况很难拿到 cre; loxp/loxp
. 可能得大规模的筛选， 规模取决于cre 和loxp的距离。 |
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C***2
发帖数: 62 | 36 Hey, i have aseveral questions to ask for help.
I want to knockin CreERT2 to specific locus, southern blotting suggested
that the ES clones are targeted correctly. But i am not sure if the CreERT2
is functional or not, therefore, i want to detect the function in vitro ES
based assay. My designed experiments is:
1) Electro-transfection of loxp-CMV Driven GFP-loxp plasmid to ES, the
transfected ES cells are split to 2 dish, one dish is treated with 4-OH,
another dish is conrol.
2) Prepare lentivir... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 472 | 37 又来请教大家关于recombineering的问题了。因为重组是一个小概率事件（就算在重组
酶存在的情况下），所以就需要有筛选的策略。最简便高效的方法可以导入一个loxP-
Neo-loxP用于positive selection，最后可以利用cre重组酶去掉Neo。缺点是会留下一
个loxP位点，也不利于在该位点进行进一步的遗传操作。
鉴于此，我们决定采用positive/negative selection的方法进行recombineering。2种
常用方法包括galK筛选和rpsL-Kana筛选。我目前采用的是rpsL-Kana方法，Kana 使细
菌对Kanamycin有抗性，rpsL是细菌对streptomycin敏感。第一步recombineering
select “kana resistance”；第二步reombineering counter-select rpsL。
经过第一步，克隆PCR鉴定可以有95%正确率，即基本上所有克隆都带有重组的rpsL-
Kana。但是第二步（将rpsL-Kana替换为insert），获得阳性克隆如同中彩票一样，概
率很低。筛200... 阅读全帖 |
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s*****r
发帖数: 477 | 38 目的是希望能在一个人细胞内做多个reporter，比如用Cre-LoxP系统，Cre插在
interest gene里，LoxP插在荧光蛋白里。如果同时研究多个基因，需要多种类似于Cre的
site-specific recombinase
我现在仅知道Cre-LoxP和FLP-FRT，请教各位有没有其他类似的系统可以在哺乳动物细胞
里应用？ |
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j**W
发帖数: 89 | 39 因为用Ｐ３－Ｐ４做的PCR，所以做sequencing的fragment应该含GFP，不会是wildtype
allele.
但是用P1做sequencing得到"wild type sequence" (不是wildtype allele),并且都过
了该是后面的loxP的地方但是还是没看见loxP。
又不是wildtype allele，后面的loxP又不见了， 所以就只能是我图上画的mis-
targeted allele这个四不象了。
我不知道还缺什么信息。不好意思。我现在说清楚了么？ |
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s******r
发帖数: 1245 | 40 他的意思是他们在exon和intron中间插了个loxP，但是sequence出来的exon后面直接就
是intron，那个loxP不见了，看上去就和wt一样。扩4k很正常，保险点的PCR一般是要
flank homo arm的看当时es怎么做的了，当然southern啥的都做了，扩短一点可能问题
也不大。
建议楼主仔细查查这个knockin当时是怎么做的，那个位置是不是应该有这个loxP，这
个设计图看着很奇怪，是不是漏了点啥或者有地方画错了。另外可以用P1测一下看看能
不能测到GFP cassette，这个长度测序末尾应该能测到外源序列的，那就确信测得是
targeted allele了 |
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j**W
发帖数: 89 | 41 You are right about a couple of things.I switch field and learned biology (
not including molecular biology) in English.And I did not make the targeting
vector. I took over the project starting from agouti mouse. Please bear
with me if I could not be clearer. I am sorry about the confusion on the
primer used for sequencing. We did sequencing with both P1 and P2. One came
back with no good sequence at all. From the sequencing result of the other,
it seems to me like P1. The sequencing result cove... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 42 想做一个老鼠模型，该模型既可以实现knockout，也可以实现overexpression。
大致方案是这样：
5‘arm-loxp- 2 Exon - 3 Exon -loxp-4、5、6Exon mini gene-PA-TRE- targetted
gene cDNA-PA-3’arm
KO由loxP控制，OE由TRE控制。
老鼠做出来后，和组织特异性Cre小鼠杂交，可以实现组织特异性敲除；和组织特异性
rtTA小鼠杂交，可以实现组织特异性过表达。
现在担心的问题是TRE启动子如果不严格，做KO的时候，就没办法敲除干净。
=====================
而且还没有看到过有文献做这样的模型。 |
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l*********i
发帖数: 332 | 43 1.DTA toxicity issues, i don't know how bad it will be, but may be better
than nothing. that is why NKCC1 provides another excellent target
2.the efficiency of nestin-cre-er to target neuro-progenitor in hippocampus
does matter.
3. hippocampus-loxP-GFP-loxP-DTA, based on transgenic, so need to select
single copy, in order to increase recombination efficiency.
and this is double transgenic strategy, oh, boy, i've got to say,
the less steps you are working on, the more success you may get about mo |
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D*a
发帖数: 6830 | 44 另外刚跟老板讨论这个问题，如果用cre /cre，cre倒是有control了，可是loxp位点没
有control了，也许你加进去的loxp位点somehow影响基因表达呢？所以我们组用的wt
mice实际上是flox/flox, 作图的时候写"control"，不写"wt"
也有人为了这个会多加一个纯粹的wt/wt作为control group, 用来跟flox/flox比较证
明flox/flox是wt的表型。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 45 还有要看你们当时是怎么决定的KO的strategy吧
像我们的老鼠敲掉的是跨膜蛋白的ligand结合位点的exon，然后敲掉之后在下一个exon
中造成移码突变，然后造成几个stop，这样就确保蛋白质没有作用。
还有我们的引物设计是这样的
引物a －－loxp－exon－－引物b－－loxp－－反向引物c
这样wt和lox是靠bc来区别，ac相比之下太长扩增效率很低，ko之后就是ac扩增，这样
wt lox excised都可以用这三个引物来区分。我觉得这种pcr比你的好些，要不你自己
重新设计引物试试吧。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 46 看你如何定义PCR鉴定
如果是KOMP那样先用loxp引物和arm外的引物扩长片段PCR,然后用loxp引物测序，5，3
端都对，我很难想象会有几个假阳性
如果就是用vector内部引物扩个带，假阳性太多了 |
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r**z
发帖数: 37 | 47 怎么确定loxP被甲基化了，这个几率太小了吧。
最可能是loxP太远，或cre效率太低吧 |
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l******u
发帖数: 936 | 48 Alfp-cre 和 loxP-stop-loxP-Gene 交. |
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j*****d
发帖数: 787 | 49 2007年的时候，炸药奖把knock-out mouse的技术发给另外三个人（1989年的发现）。
但实际上1994年cre/loxp技术已经发明出来了。当时，2007年的时候，是不是有人替他
惋惜呢？
cre/loxp技术超越一般的KO 技术有点类似于 smart phone超越 普通cell phone. 玩
mouse genetics的人那叫一个得心应手。。。。
他在免疫界的声望更不待言。
还有，这老家伙居然又杀回德国了。哈哈。我去年关注他的时候还没有这条新闻。
http://www.nature.com/news/2010/101223/full/news.2010.696.html |
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s**********r
发帖数: 13 | 50 cre 始终和loxp配不到同一只小鼠中,cre,loxp和minis两两都可以配到一只小鼠中. |
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