b****n
发帖数: 311 | 1 Nature Genetics也不难：
1: Huang XY, Chao DY, Gao JP, Zhu MZ, Shi M, Lin HX. A previously unknown
zinc
finger protein, DST, regulates drought and salt tolerance in rice via
stomatal
aperture control. Genes Dev. 2009 Aug 1;23(15):1805-17. PubMed PMID:
19651988;
PubMed Central PMCID: PMC2720257.
2: Sun SY, Chao DY, Li XM, Shi M, Gao JP, Zhu MZ, Yang HQ, Luan S, Lin HX.
OsHAL3
mediates a new pathway in the light-regulated growth of rice. Nat Cell Biol.
2009
Jul;11(7):845-51. Epub 2009 Jun 21. PubMed PM... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 2 一端是2'F RNA，另一端是DNA，splint template是DNA，这样DNA ligase会
work吗？呵呵 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 不知道你说的什么意思
但是如果要让DNA连到RNA上
T4 RNA ligase可以
不过你要当心自连
合成引物的时候注意一下
哪边要磷酸集团
那边不要 |
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s***m
发帖数: 6197 | 6 就是既要有polymerase的功能，又有ligase的功能 |
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s******s
发帖数: 13035 | 7 这个和加polymerase和ligase有啥区别？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 所以我就很坚定的人为生物不是智能设计出来的，而是在进化中到处打补丁
打出来的。呵呵呵。
以前学分子生物的时候就很气闷，有些酶有很多种亚基，偏偏好几个功能
都是其中一个苦命的亚基一作的，而另外几个亚基都懒洋洋的要么只有一个功能，
要么就只有一个辅佐主亚基的功能，要么就根本不知道在干什么。
当时考试的时候就很愤怒的想，如果这个东西是上帝设计的话，干吗不让功能一
让亚基一做，功能二让亚基二做，功能三让亚基三做，等等等等？
这样一来也省得亚基一累坏了，二来我们考试要记这些东西的时候也方便一点？
ligase
dna |
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s***m
发帖数: 6197 | 9 呵呵 对呀 但是我不是搞蛋白设计的 我只是想问问有没有这种蛋白 我想用它
如果你哪天发现不是你的幻觉 发信通知我哦 谢谢啦
ligase
dna |
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z*******a
发帖数: 175 | 10 谢谢
knockdown和overexpression的是一个E3 ubiquitin ligase， phenotype属behavior
请问还有其他可能性吗 |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 A system for the continuous directed evolution of
biomolecules
Kevin M. Esvelt1, Jacob C. Carlson2 & David R. Liu2,3
Laboratory evolution has generated many biomolecules with
desired properties, but a single round of mutation, gene expression,
screening or selection, and replication typically requires days or
longer with frequent human intervention1. Because evolutionary
success is dependent on the total number of rounds performed2, a
means of performing laboratory evolution continuously and
rap... 阅读全帖 |
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k*****n
发帖数: 417 | 12 Their top5 highly cited research papers:
Wei Gu:
Title: Negative control of p53 by Sir2 alpha promotes cell survival under
stress
Times Cited: 822 (from Web of Science)
Title: Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and
apoptosis
Times Cited: 331 (from Web of Science)
Title: Deubiquitination of p53 by HAUSP is an important pathway for p53
stabilization
Times Cited: 319 (from Web of Science)
Title: Mono-versus polyubiquitination: Differential control of p53 fate by
Mdm2
Times Ci... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 个人觉得TA clone不咋好用
TOPO blunt end很好用，注意要买II，不是I，I还是要用ligase的
TOPO blunt end II就是PCR产物直接跟vector室温混半小时
然后transfer |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 有没有人知道有什么例子里，一个蛋白的磷酸化既能改变它的活性（比方说对
下游靶蛋白的磷酸化增强，或者对其他蛋白结合里增强），同时又加快它的
降解速度的？
这种例子理论上应该是有的，比方说一个蛋白不磷酸化的时候分子是合起来的，没有活
性，但是一旦磷酸化后把蛋白展开来了，活性基团暴露出来的同时也就招来Ubiquitin
ligase所以降解变快，等等，似乎上学的时候再在生化课还听过。但是我一下子实在想
不起什么事例来了。哪位同学知道的来指点一下？先谢过了！ |
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c********b
发帖数: 363 | 15 1 phosphatase, instead of degradation, could regulate the function.
2 could u define activity specifically? It is hard to imagine functioning
while degrading. If u mean protein binding as activity, binding to ubiquitin
e3 ligase counts
Ubiquitin |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 貌似没有听说过，因为E3 ligase 有一定的特异性。
当然，不能排除某些蛋白躺着中弹的可能性 |
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g*****n
发帖数: 241 | 17 我直觉上觉得分泌型蛋白未必会马上被降解，因为分泌出去之后没有ubiquitin ligase
之类的蛋白去标记然后降解它。除非直接结合膜上的受体然后被内吞。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 有所谓的co-translational degradation pathway, 细胞如果看到不顺眼的
蛋白，就一边合成一边降解了。
在极端的例子里能看到ribosome弄出来的一条多肽直接连到proteasome上 ，
简直就是直接送焚化炉了。
ligase |
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m******5
发帖数: 1383 | 19 by which method did you dephorsphorylate your plasmid? I usually got most of
plasmid self ligased |
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g*****n
发帖数: 241 | 20 我觉得我做的一个E3 ubiquitin ligase可能可以ubiquitinate另一个蛋白，想做个In
Vitro Ubiquitin Assay验证一下。但我们实验室不做相关的实验，想找大家推荐一个
性价比比较高的kit。
谢谢 |
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X***n
发帖数: 366 | 21 Without clearly define, the question is hard to answer.
It may be solved by using ligase.
利用什么方法，能把只有一两个bases不同的small dsRNA区分开来？谢谢
★ Sent from iPhone App: iReader Mitbbs 7.28 - iPad Lite |
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h*****u
发帖数: 201 | 23 如果要把一段外来的基因（比如一个plasmid或者染色体里面的一段已知基因）复制出
来，插入到另一个plasmid或者染色体的特定位置去，是怎么操作的？定位的原理是什
么？
我找了些资料，似乎传统的方法是根据特殊的restriction enzymes和DNA ligases来定
位。又发现最近的一些文献里用lambda red system来进行基因改造。两种方法的原理
我都没看明白，请版上的朋友不吝赐教。。。谢谢！ |
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z*h
发帖数: 773 | 24 try this new technology -- Simple Cloning.
You, C., X.-Z. Zhang, and Y.-H. P. Zhang. 2012. Simple Cloning: direct
transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and
Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol.:doi:10.1128/AEM.07105-07111.
Abstract
We developed a general restriction enzyme-free and ligase-free method for
subcloning up to three DNA fragments into any location of a plasmid. The DNA
multimer generated by prolonged overlap extension PCR was directly
transformed in E... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 25 原理上来说，是否RNA ligase mediated 5'RACE得到的一定是有效的5‘末端，也就是
individually transcripted，而非降解或者unspecific splicing产物？
我目前的理解是这样的，但因为结果太奇怪，上来问一下.
另外，还有一个问题,putative ATG前面允许存在Exon-Exon junction么？ |
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s*********t
发帖数: 600 | 26 我在研究一个转录因子。它作为转录因子在细胞核内的功能已经比较清楚了，而我发现
它主要在细胞质里面分布，纯化其在细胞质里面的interaction蛋白，发现其相互作用
蛋白主要是一个E3 ligase， Ubr4.
请教这样该如何进一步研究？还是说没有什么有意思的？
谢谢 |
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k****o
发帖数: 589 | 27 E3 ligase估计是给这TF的turnover起作用的。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 28 谢谢两位的建议。
To aardlbx: 表型我在线虫里面已经有了，我们实验室是做线虫遗传的，所以没法按照
做mouse model的实验室的方法去研究肿瘤抑制（我也希望能做到这样的结果，只可惜
实验室条件不允许）。你所谓的完全的mechanism是指什么？找到负调控的机制，比如
找到ubiquitin ligase吗？
To Oncogene: 我之所以想试试Science，是因为我们实验室以前有过一篇类似的发表在
Dev Cell上，而且那篇论文只是在线虫里面做。我这次的课题还延伸到了人里面，证明
了这样的调控在人里面也是保守的，所以想试试更高的杂志。但如果不行的话我个人更
倾向于Dev Cell。但也想听听版上前辈和同僚的意见。
再次感谢 |
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s******a
发帖数: 252 | 31 So it's Barkai's student.
1 Science, 1 Nat Genetics.
That's outstanding but not surprising.
Publications:
Tsui K, Dubuis S, Gebbia M, Morse RH, Barkai N, Tirosh I, Nislow C (2011).
Evolution of nucleosome occupancy: conservation of global properties and
divergence of gene-specific patterns. Mol Cell Biol. 31:4348-55.
Dori-Bachash M, Shema E, Tirosh I (2011). Coupled evolution of transcription
and mRNA degradation. PLoS Biol. 9(7):e1001106.
Tirosh I, Barkai N (2011). Inferring regulatory mechani... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 32 在排除样品质量的情况下
用RNA ligase mediated 5'RACE得到的transcription starting site和最早报道的用
cDNA library测序得到的starting site很不一样 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 So should conside linked proteins pair its flolding or scafolding even
posstible proteasome by stuff E3 or other ubiquitn ligase etc problems
litte bear his opinion that is VIP. ----matrix one cent |
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F*K
发帖数: 608 | 34 想研究Ubiquitination对一个蛋白定位是否有影响，但不知道其特异的E3 ligase，也
没有map Ub的修饰位点，请问有什么办法可以快速的测试一下？ |
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o**d
发帖数: 3080 | 36 你想问的是ubuitination的底物有没有保守的motif吧，肯定都有个K。但motif好像没
有听说过。 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 37 有啊,SCF 的低物需要被在保守为电磷酸化,才能被E3 识别和泛素化 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 38 很多E3需要被neddylation才能有彻底激活 |
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a*****x
发帖数: 901 | 39 你说的是cullin吧。他们其实不是E3,只是E3的主要subunit。而且cullin也没有明确的
target的保守motif |
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a*********n
发帖数: 2526 | 40 既然cullin 是E3 subunit, cullin 的neddylation 我是不是可以说是E3的
neddylation? |
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h*****4
发帖数: 36 | 42 你指的是huamn的？如果是08年的，那这个记忆可能不准确。
以human为例，目前只知道两个E1吧？E2 40-50个，E3 500-1000个。 |
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h*****4
发帖数: 36 | 43 就现有的了解，一般来说是K，但不绝对。另外有另外预测泛素化位点的工具，但未必
准确。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 44 试试RLM-RACE？
就是RNA ligase mediated RACE
文献搜索一下 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 45 看了一下，那个kit里面还是用的dT-anchor primer来做cDNA synthesis的
很大程度上这一步的效率取决于这个VTTTT-anchor primer跟poly-A tail的结合程度
我个人觉得既然你现在做不出来
很有可能是cDNA synthesis这一步就已经效率很低
我当时做RLM-3’RACE的一个原因就是原核没有poly-A tail
没有办法用poly-T的primer来做cDNA synthesis这一步
RLM-3'RACE带来的好处是
mRMA3'连上adaptor以后
后面的cDNA synthesis用的是adaptor specific oligomer
这个效率会有不同
如果已经山穷水尽，这个结果又一定要做出来
可以试试这个RLM-RACE的方法
不过就是多设计个引物，买点T4 RNA ligase而已
Roche的反转录酶还是不错的
～～～～～～～～～～～～～～～～～
另外如果你担心是因为mRNA的二级结构有影响的话
在把RNA加入cDNA synthsis反应之前
可以95度加热RNA3分钟，然后立刻放在冰上，冷却以后再用 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 不需要kit啊
你再好好读一读RLM-RACE的文献
你需要买的就是， oligomers
还有T4 RNA ligase而已
反转录酶、PCR用的kit你已经有了 |
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o**d
发帖数: 3080 | 47 如果H蛋白本身是E3 ligase，自泛素化的可能性就很大。但也有可能只是个泛素化的底
物。如果MG132处理之后，H蛋白的量增加，说明很很可能是K48－ubi，如果没有增加，
也有可能是K63－ubi。 |
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L*****t
发帖数: 56 | 48 老板负责学校一个生物技术课程的教务，自己也会带几个本科生。这次新进实验室的一
位，女，华裔，长相抱歉不过自我感觉良好。第一天参观实验室的时候居然端着一杯咖
啡一边喝一边打招呼，还没来得及阻止就被实验室主任看到了，一通训斥后此人眼望天
空一言不发，反而是我和老板不停的道歉。
第一个实验是LB平板上挑单克隆，此人称自己会做那我就我让她挑3-4个培养。在旁边
看了几秒就发现不对，用来挑菌的枪头居然不换就继续挑下一个，赶快叫停，花了10分
钟解释什么是无菌操作，确定她听懂了后我有事离开一会儿，回来的时候发现实验台上
一堆垃圾，还有一瓶没上盖子的培养液，人早已不知去向。
第二天做酶切的时候再次犯晕，吸过样品的枪头不换直接去吸酶。我指出问题，答曰“
这几个质粒应该都是一样的，为什么要换”。!@#$%^&* 这支全新的SmaI恐怕以后只有
她自己能用了。
双酶切第一步要求25度水浴培育一小时，重复了好几次都切不开，仔细询问后才明白此
人认为25度=室温，就把EP管在室温放了一个小时。问题是实验室常年缺乏日照，异常
阴冷，墙上的温度计显示室温是18度，当然切不开。最后是昨天把一个装着T4 Ligase... 阅读全帖 |
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s**u
发帖数: 9035 | 49 He has 12 papers, 3 of which are first-author papers. see below
Differential regulation of androgen receptor by PIM-1 kinases via
phosphorylation-dependent recruitment of distinct ubiquitin E3 ligases.
Linn DE, Yang X, Xie Y, Alfano A, Deshmukh D, Wang X, Shimelis H, Chen H, Li
W, Xu K, Chen M, Qiu Y.
J Biol Chem. 2012 Jun 29;287(27):22959-68. Epub 2012 May 14.
PMID:
22584579
[PubMed - indexed for MEDLINE]
Related citations
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A Role for OCT4 in Tumor Initiation of Drug-Resistant Prostat... 阅读全帖 |
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s**u
发帖数: 9035 | 50 Dr.Xie has 12 papers, 3 of which are first-author papers. see below
Differential regulation of androgen receptor by PIM-1 kinases via
phosphorylation-dependent recruitment of distinct ubiquitin E3 ligases.
Linn DE, Yang X, Xie Y, Alfano A, Deshmukh D, Wang X, Shimelis H, Chen H, Li
W, Xu K, Chen M, Qiu Y.
J Biol Chem. 2012 Jun 29;287(27):22959-68. Epub 2012 May 14.
PMID:
22584579
[PubMed - indexed for MEDLINE]
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