m******5
发帖数: 1383 | 1 people usually get much broad pattern using X-gal staining since it is
disproportionally more sensitive than to use antibdy to stain LacZ.
Think this way: if antibdy works so well, why did you even bother to make
LacZ reporter in the first place? |
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m******t
发帖数: 109 | 2 在用LACZ 作 LINEAGE TRACING。 LACZ 是DOX INDUCED的。 现在的问题是没有蓝色出
来了。同时的POSITIVE CONTROL是有的， 说明染色是没问题的。 可能１， DOX没作用
到， ２ 多次CROSS把哪里弄坏了。 请有经验的各位指导一下。 多谢 |
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z****u
发帖数: 1007 | 3 antibody不会比lacZ staining更准确敏感。 如果没染出来lacZ那可能就是没有
lineage derivation. |
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m*****n
发帖数: 760 | 4 在小鼠中表达lacZ reporter，X-gal的staining很好，
可是试了Millipore和Sigma的antibody staining，结果却不能detect。
有没有好的推荐啊？ |
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s****9
发帖数: 932 | 5 Abcam anti-lacZ for IHC works well |
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z****u
发帖数: 1007 | 6 Abcam那个能用。想要得出和LacZ一致的pattern得把anibody和TSA kit结合起来用。我
就是在这个上面花了很多时间来optimize TSA protocol. |
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T****i
发帖数: 15191 | 7 还有STRE-lacZ reporter plasmid, 介绍一下，或请给个reference。拜谢了。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 8 简单得很。直接把尾巴放进LacZ 染液里面37度 几个小时就成了。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 急问做过C12-FDG LacZ staining的同学，在staining的过程中red signal bleed
through 厉害么？ 我目前看到的信号很特意，但red bleed through很严重 |
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z****u
发帖数: 1007 | 10 建议换一个reporter, 比如用tdtomato reporter.LacZ 总体来来说不如Tdtomato敏感
。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 11 上面说批次之间有差异啊。
话说染LacZ 难道只能用paraffin吗？ |
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p*********9
发帖数: 14 | 12 批次之间的差异不太清楚，我每次都会加一个没有Lacz的样品做negative control，所
以觉得还好 。后来好像还染过 skin，也没问题 。如果不用paraffin可以用frozen的
然后直接加底物显色吧 |
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M******s
发帖数: 138 | 13 先染lacz再石蜡包埋再切，形态会非常好，缺点也很突出，就是已经处理过，就不能连
续切片做近似原位比较了，比如切十张sections第一lacz第二he第三ihc....这样第一
和最后相差不过0.1mm，基本可以认为是同一位置，形态也差不多，肉眼看是一样的。
所以如果多用途组织不适合先染lacz再石蜡包埋。
如果我没有理解错的话，不固定的组织，就不用泡蔗糖溶液了吧。
对，没有固定的组织绝对不能泡，会烂掉
要是泡蔗糖溶液，我看一般说是等组织沉到溶液里，这个一般大概会要多长时间。
固定后泡糖，实际上光沉底是不够的，尤其对于大块组织是这样，不过小组织24h,大组
织48h,中间换一到二次液体，基本就可以了
还有一个肠子的问题，看到有人说肠组织很容易autolysis，我如果想看其中的lacZ的
话，是不是不固定，不泡蔗糖，直接速冻也没有问题。
这个问题是因为酶含量高，对于低温保存组织是没有问题的，80度冰柜里基本没有活性
了，不用担心，切片时间短，切完冻起来也没事，但是要用以前从冰箱里拿出来就要尽
快做。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 14 谢谢，大包子奉上。
还有一个小疑问，切好的片子可以直接-80C保存吧，不用先室温Dry吧。
先染lacz再石蜡包埋再切，形态会非常好，缺点也很突出，就是已经处理过，就不能连
续切片做近似原位比较了，比如切十张sections第一lacz第二he第三ihc....这样第一
和最后相差不过0.1mm，基本可以认为是同一位置，形态也差不多，肉眼看是一样的。
所以如果多用途组织不适合先染lacz再石蜡包埋。
如果我没有理解错的话，不固定的组织，就不用泡蔗糖溶液了吧。
对，没有固定的组织绝对不能泡，会烂掉
要是泡蔗糖溶液，我看一般说是等组织沉到溶液里，这个一般大概会要多长时间。
固定后泡糖，实际上光沉底是不够的，尤其对于大块组织是这样，不过小组织24h,大组
织48h,中间换一到二次液体，基本就可以了
还有一个肠子的问题，看到有人说肠组织很容易autolysis，我如果想看其中的lacZ的
话，是不是不固定，不泡蔗糖，直接速冻也没有问题。
这个问题是因为酶含量高，对于低温保存组织是没有问题的，80度冰柜里基本没有活性
了，不用担心，切片时间短，切完冻起来也没事，但是要用以前从冰箱里拿出来就要尽... 阅读全帖 |
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w*e
发帖数: 740 | 15 我感觉用比较好的LACZ 引物就应该可以/
看看哪个文献上报道其他LACZ的KI老鼠，如果他们的引物能同时PCR出WT 和LACZ
不同的2个带，你就应该可以用（如果你的老鼠本身造的没问题）。
具体设计引物，估计你得咨询做TARGET VECTOR的哪个人 |
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s******r
发帖数: 2876 | 16 太感谢了。
我就是收集tissue作染色。
如果我没有理解错的话，不固定的组织，就不用泡蔗糖溶液了吧。
要是泡蔗糖溶液，我看一般说是等组织沉到溶液里，这个一般大概会要多长时间。
还有一个肠子的问题，看到有人说肠组织很容易autolysis，我如果想看其中的lacZ的
话，
是不是不固定，不泡蔗糖，直接速冻也没有问题。
Mouse tissue请问大家一般是先fix，还是先frozen？
看是什么目的用途，传统组织学用途先fix，其他用途例如dna,rna 或不适于fix的组织
学用途先freeze.
一般组织在-80C冰箱能不能长期存放，固定之后冰冻，能不能保质期长一点。
当然能长期放，固定或许保质期会长，但这不是重点，重点还是你的目的和组织的用途
，另外一点一定要注意，fix后的组织要冰冻保存，一定要经过tissue cryoprotection
,传统做法就是糖溶液浸泡。
如果直接冰冻，那些有空腔的组织比如肠子，胃是不是先得灌一些OCT。或者新鲜肠子
能像福尔马林固定那样切开，再卷成卷后冰冻。
都可以，其实因为要切成段再冻到oct里，不必纵向切开，也不必专门去灌，oct自然会
充... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 17 会不会Cre从转录到翻译，再到重组lacZ Reporter需要时间。
有Rosa26，是一个大家都不知道有什么用的位点，所以往里面加东西，理论上对其他基
因没什么影响
但是GFP的efficiency要先保证，才能保证你的pattern是真正的pattern，这里面有多
少个gfp你才能肉眼可见的问题，有从genomic KO到gfp protein表达的问题，有这个细
胞愿意不愿意gfp在那里呆着的问题
我们用rosa26 LacZ的老鼠，做出来的cre表达time line比直接用pcr晚。 |
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m*********n
发帖数: 215 | 18 你这是啥基因啊？ 有可能是你用的taq／pfu etc.等酶用来selection的基因。我们曾
经需要genotype Lacz，觉得总是污染，但是genotype其他基因都没问题。和楼主一样
所用东西都用新的之后还是不对。后来发现换了一种taq酶之后就好了。我们一致认为
是之前用的那一种taq用lacz筛选过。楼主可以换个公司的酶试试。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 没有这么做过，我们都是用荧光蛋白的。
如果是用Gal-Lacz系统的话，就必须把细胞给固定了，这样筛出来的就不是
活细胞了.
而且LacZ染色一般都是黑咕隆咚的，属于absorption-based screening,
我不知道一般的sorting device 有没有能力用这种方法来分细胞，即使有，也
需要比较强的光才能分出染色和没有染色的细胞。 |
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M******s
发帖数: 138 | 20 Mouse tissue请问大家一般是先fix，还是先frozen？
看是什么目的用途，传统组织学用途先fix，其他用途例如dna,rna 或不适于fix的组织
学用途先freeze.
一般组织在-80C冰箱能不能长期存放，固定之后冰冻，能不能保质期长一点。
当然能长期放，固定或许保质期会长，但这不是重点，重点还是你的目的和组织的用途
，另外一点一定要注意，fix后的组织要冰冻保存，一定要经过tissue cryoprotection
,传统做法就是糖溶液浸泡。
如果直接冰冻，那些有空腔的组织比如肠子，胃是不是先得灌一些OCT。或者新鲜肠子
能像福尔马林固定那样切开，再卷成卷后冰冻。
都可以，其实因为要切成段再冻到oct里，不必纵向切开，也不必专门去灌，oct自然会
充盈到腔内。
没固定的组织切片一般大家如何固定，固定好的片子能不能长期保存。
关于切片的post-fix，现在用的基本有两类方法，1。 以4%PFA为主的配方，机理大致
是蛋白凝固，优点是固定效果好，缺点是会有交联。
2. 丙酮等有机溶剂浸泡，机理大致是蛋白凝固和脱水，优点组织形态好且无交联，缺
点不能室温长期保存，低温保... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 21 石蜡应该不合适，有人说LacZ不能耐受有机溶剂。
肠子这样的组织 能不能石蜡包埋切片 应该一样可以看到lacz |
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h**********r
发帖数: 671 | 22 我做微生物的lacz assay,手上待测和重新engineer的promoter有30多个吧，用lacZ的
酶活来看不同promoter的activity.有的还得用不同的诱导条件。
想在自己实验室反应完全后再出去测。
没想到这么挫啊！用分光光度计测还行，就是累和太费比色皿。 |
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t******k
发帖数: 5617 | 23 transgenic mice的lacZ staining和senescence associated b-Gal staining (SA-b-
Gal)是不是染色的PH条件不同？
如果有lacZ的b-Gal staining kit能不能用来测SA-b-Gal？ |
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H****N
发帖数: 997 | 24 The purpose of conditional ko is to delete the gene at the desired place and
time and to avoid embryonic lethality. Your mice is KO first, meaning it is
KO already if you don't delete the LacZ cassette; crossing with Cre is
meaningless. If KO of your gene is not embryonicaly lethal, you don't have
to cross it to Cre. If it is, you then have to delete the LacZ first, then
cross with Cre. |
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b******n
发帖数: 4559 | 25 不是吃胖长肥肉，都是肌肉。影片里举重的镜头都是举得真的重量。
BC was able to do dead lifts of 415 pounds, five sets of eight reps each。
he consumed an insane 6,000 calories a day — and had to be force-fed!
Chris Kyle's close friend, former Navy SEAL sniper Kevin Lacz, was chosen to
train Bradley Cooper and ended up in the film with the star；
Within days, Cooper, lying on his belly behind a telescopic sight, was able
to hit a ten-inch target from a distance of 600 yards |
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b******n
发帖数: 4559 | 26 "American Sniper" writer-producer Jason Hall revealed to People magazine
that Cooper "was eating about every 55 minutes" and that "he was determined
to do it naturally, he didn't want to use any hormones or steroids or
anything. He was just very systematic about it and took his trainer with him
wherever he went."
When it came to actually using a rifle, Cooper trained with a real Navy SEAL
sniper Kevin Lacz, who served with Kyle and was a consultant on the movie.
"He actually proved himself to be... 阅读全帖 |
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n***h
发帖数: 11 | 27 照我的记忆说来：
yeast 2 hybrid system是两个蛋白之间的binding
yeast 1 hybrid是蛋白质和DNA之间的binding ，就象ras说的，测出的是bait和
fragment之间的结合，可以象ras说的那样fragment是library, 来找和已知蛋白
结合的特定element，也可以特定的fragment，转cDNA library进去，找和这个
fragment 结合的蛋白。 （infact that's what I did)
回来说2hybrid。transcriptional factor一般至少有两个domain: binding domain
和activition domain. binding domain binds to DNA elements, while activation
domain activates the transcription of downstream genes. 我们要测试蛋白A
和蛋白B是否bind, 就做以下两个construct：
—————————— —————————... 阅读全帖 |
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M****e
发帖数: 70 | 28 expressing of interested protein in large quantity with the
help of appropriate vector in proper host. at first, biologists
developed plasmids as expression vector for "overexpression"
of certain gene in the bacteria host.for example, the mosar popule lacZ operon) and then
"overexpress" the exogenous protein in bacteria. however, since
the prokaryotes lack post-translational modifications of the
proteins, people developed other systems such as yeast, insect
cells as well as transformed mouse, mo |
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a***e
发帖数: 1010 | 29 is lacZ same as beta-Galactosidase? |
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y****r
发帖数: 234 | 31 yes, lacZ is the gene encoding beta-galactosidase. |
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i********d
发帖数: 7 | 32 3T3-L1细胞转了lentivirus，用10ug/ml的Blasticidin筛选，现在9天了，LacZ-
Lentivirus转的细胞死的差不多了，能看见单个clone了，不过我自己做的lentivirus
转的细胞还是很多，下面该怎么办？提高Blasticidin的浓度？
或是我这个基因对细胞有保护作用？多谢指教！ |
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i********d
发帖数: 7 | 33 没有做不转染的control，做了LacZ lentivirus的转染，细胞基本死光光。两个转染一
起做的。 |
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w***e
发帖数: 269 | 34 Here is the problem. We recently developed a mouse knockout line with a
company. The entire gene is knocked out with all the exons and introns
being replaced with a reporter gene (lacZ) cassette. We got the
heterozygous (+/-) mice and I did the breeding. But now I have trouble
genotyping to find out the knockout mice (-/-). I tried two pairs of
primers in that gene to PCR out ~400 bp fragments in the last exon (the
biggest exon which codes the functional domain of the protein). PCR with
one pai... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 35 有Rosa26，是一个大家都不知道有什么用的位点，所以往里面加东西，理论上对其他基
因没什么影响
但是GFP的efficiency要先保证，才能保证你的pattern是真正的pattern，这里面有多
少个gfp你才能肉眼可见的问题，有从genomic KO到gfp protein表达的问题，有这个细
胞愿意不愿意gfp在那里呆着的问题
我们用rosa26 LacZ的老鼠，做出来的cre表达time line比直接用pcr晚。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 36 我们是跟target organ 的 target gene 的 genomic pcr比的。
pcr有带的时候，lacZ很淡很淡还是没有，我忘了。
当然，这个也许恰好反映了一个蛋白质从KO到表达的时间。。。 |
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f***4
发帖数: 886 | 37 我们想做两个转基因小鼠，做发育fate mapping
不能用GFP/DsRed来源的蛋白，请问除了LacZ外，还有什么蛋白？
GST之类的能用在转基因吗？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 38 也许他插入的那里本来就是个甲基化位点也说不定，也不是我的老鼠，我就当听故事，
谁还深究啊
cre一般都有reporter gene，像lacz什么的验证的吧。cre管用不管用应该还是比较好
分别 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 39 use cre reporter mice. Such as YFP, LacZ. |
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a*****g
发帖数: 543 | 40 做个lacZ的reporter breeding吧。
promoter的specificity 也不是百分之百的，做一个reporter strain的breeding能回答
不少问题。
surfactant |
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i*****n
发帖数: 53 | 41 breed to reporter mice 才是正解。 比如有一种老鼠 在LacZ 之前有 floxed stop
codon. |
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D*a
发帖数: 6830 | 42 那还是用 reporter mice 吧，一边是你的细胞有cre的细胞有lacZ或者xxFP，你还可以
做几个epithelial cell特异性的marker，double markers。
surfactant |
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m******5
发帖数: 1383 | 43 谢谢回复！！
说到sorting,你有用FACS-Gal sort过lacz expressing line么？
protocol到处都有，但文章上大家还是爱用EGFP/DsRed expressing来 sorting，是有
什么trick在里面么 ？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 44 有一个protocol是用FACS-Gal一个荧光底物，被LacZ催化后释放出FITC，
看着不错，而且针对活细胞，不过确实在细胞suspension后多了一步处理，而且背景可
能会比较大 |
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y******8
发帖数: 1764 | 46 beta Gal的抗体特异性很好，如果做酶染也比Gfp灵敏很多倍。如果单纯作表达
reporter，illum assay比luc弱一点，但是也很接近。
如果选全能，LacZ可能是最好的。
control |
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c******r
发帖数: 3778 | 47 你的promoter有多长？
lacZ好像蓝了就是蓝了，不能定量吧？
GFP也可以啦，如果你愿意做很多flow，还是不错的。
luciferase也不错，比较sensitive。但是呢做不好就不是很容易repeat。
western只能粗略定量，差别很大还可以。差别小了不行。
如果promoter不太强，还是luciferase比较简单，出数据快啊
control |
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z****u
发帖数: 1007 | 48 要做诱导还可以做doxycyclin诱导tTA或者rtTA啊。
比如这样一个
XXX-rtTA;tetO-Cre；XXXfl/fl
虽然是triple transgenic..但是理论讲，在没有诱导
前是没有phenotype, 完全vital的。所以一旦拿到了triple transgenic strain就可以
拿非诱导的mice来keep line以及generate new pups.效率会高很多。我现在在做的耗子就是triple transgenic.如果算上里面的R26R-LacZ reporter那其实是tetra-transgenic.
生成第一个triple transgnic strain需要大概半年时间。
做CMV-Cre全身诱导的问题一来是缺乏tissue specificity.二来那个未必在全身都会有同样的效率。我记得好像CMV-CreER在liver 和lung的效率就不好。反正实在没法了才来这个。
诱导系统目前就doxycyclin和ERT俩了。Jax lab都有。没事上JaxLab网站浏览他们的各种mouse lines很有意思的。 |
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d****7
发帖数: 109 | 49 书里都是那么说的，具体细节我估计没人清楚。而且formaldehyde crosslink protein
-dna只是理论上的，如果你看最早的那篇发明ChIP的文章，文章里说，在in vitro的情
况下，formaldehyde只能有效的crosslink nuceosome-dna interaction，但是却不能
crosslink TF-DNA （他们似乎只测试了lacz）。
另外，modENCODE的Julie Ahringer跟我们说，她和Steven Henikoff都觉得
formaldehyde不能有效的crosslink protein-dna，而大家在做ChIP的时候，只是将
nucleosome crosslink到DNA上，然后其他的TF只是crosslink到nuclesome上了，间接
的crosslink到DNA上。
对于reverse crosslink，只是习惯性的加热overnight。
formaldehyde的浓度，大家用的差别还是挺大的，有些人用1%，有些人用1.5%，有些人
室温crosslink，有些人37度，有些人在formalde... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 50 I have a question on this:
Thus said, the method proposed by LZ would be a very good strategy to
produce hypolymorphic allele? since most mRNA are subjected into non sense
mediated decay, so the protein level would be reasonably low.
And where to search for EGFP/LACZ trapped ES cell line? I searched around
but found only few available trapped locus, could you recommend some company
making good use of it?
level |
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