l**********1
发帖数: 5204 | 1 Please go to
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2518226/
>Overall, our results suggest that PUB22 and PUB23 coordinately control a
drought signaling pathway by ubiquitinating cytosolic RPN12a in Arabidopsis.
Subcellular Localization
The sGFP cDNA clone was fused in-frame to the 59 end of the full-length
PUB22 and PUB23 coding region and ligated into the pBI221 transient
expression vector. The sGFP-PUB22 and sGFP-PUB23 fusion constructs
were transformed into protoplasts prepared from wild-typ... 阅读全帖 |
|
I***a
发帖数: 13467 | 2 polytron homogenizer,
不过我用得不是很理想，之后还用了beads，再打一遍。 |
|
c***y
发帖数: 615 | 3 能详细讲讲你处理的是什么样品吗?具体homogenizing step.
多谢 |
|
|
g********0
发帖数: 6201 | 5 给你推荐个小仪器 bullet blender
www.wisbiomed.com/ec/index.php?main_page=product_info&products_id=77
原理是用不锈钢珠直接在裂解液里高速击打粉碎组织
一次可同时处理24个样品，放在4度冷室里
心脏组织6分钟，肝组织2分钟，匀浆完基本看不到渣滓。本人亲自实践经历。 |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 7 贵么？大概得多少钱？ 有没有打破管子的事情发生过？
其实我最想用来处理同位素标记的样品，因为不可以用超声波。
但是用这种粉碎仪又担心万一管子破在机器里面就更麻烦了。 |
|
|
|
g********0
发帖数: 6201 | 10 我还没经历过打破管子的情况。
它里面的击打锤也是硬塑料的。
说实在的，这就是一个电动的拨浪鼓 。
结构简单的象个玩具。
钢珠是消耗品，有各种规格大小，需要另买。
还有专门提RNA用的无RNA酶的钢珠。 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 11 Damn, 1000 dollar cheap!
thank you. |
|
h*******o
发帖数: 4884 | 12 我们实验室一直用bullet blender,这个玩意儿自己寿命也有限
2年以后效果就比刚开始差很多,大概看了一下,里面那个敲的棒子都磨损了
要换一个,价钱和买个新的差不多了.
所以建议不用买那种特别贵的
我们现在用的就是1000多一点的,3年换一个挺好 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 13 谢谢！
你要是看到便宜的imaging-based automated cell counter 也跟我说一下吧。呵呵 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 14 can you give me a link of 1000多一点的? |
|
|
h*******o
发帖数: 4884 | 16 我们用的就是上面链接里面的那个,不过不带温度的
都是放在冰柜里面或者cold room里面用
记得当时是1000多的特价. |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 17 fyi:
if your
each sample ≦3 ul read volume:
//www.bulldog-bio.com/adam_mc.html
or
3.1 ul ≦ each sample ≦20 ul read volume:
20 μL sample volume,
Dual fluorescence plus bright field imaging Disposable counting chamber:
//www.integratedscientificsolutions.com/wp-content/uploads/2011/06/Nexcelom-
Flyer-2000.pdf |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 18 Hi, guagua,
how much lysis buffer for one mouse whole heart usually you add? |
|
g********0
发帖数: 6201 | 19 whole heart也太大了吧。我们一般切３０－５０毫克大小的块，加４００－５００微
升lysis buffer。 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 20 the reason I want whole heart is that I think a lot genes are not evenly
distributed in heart.. |
|
h********n
发帖数: 4079 | 21 我用qiagen的那个tissue lysor, 还行, 不会破.
不过我更推荐震动频率高一点的, beads比较小, 效果更好. 大概不到一万 |
|
|
g*********5
发帖数: 2533 | 23 I bought the machine now.
but the tube need separately purchase...
I have some start kit beads, and can I use the 1.5 ml Eppendorf tube
directly? 1ml lysis buffer?
thanks. |
|
s*********t
发帖数: 600 | 24 另外，第一次得到的上清和细胞核pellet，我们实验室还有人再次用低盐溶液洗涤一次
细胞核pellet。可是我试过一次，细胞用homogenizer捣过之后，再离心，得到的
pellet已经有黏糊糊的倾向了，是不是细胞核也破碎了？如果再次洗涤，我担心细胞核
蛋白会损失。所以我都不洗涤。
所以做western检测quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。
所以我现在最烦做从大量细胞制备NE，S100的实验，因为跟文献的方法总是有些修改，不同的文献使用
的方法也不同，同个实验室，不同的人用的都不同，让我无所适从。 |
|
a****k
发帖数: 1130 | 25 J Bioenerg Biomembr. 2002 Dec;34(6):423-31.
Expression and characterization of recombinant human cytochrome c in E. coli.
Jeng WY, Chen CY, Chang HC, Chuang WJ.
Source
Department of Biochemistry, National Cheng Kung University College of
Medicine, Tainan 701, Taiwan.
Abstract
Cytochrome c is a heme protein involved in electron transfer, cell apoptosis
, and diseases associated with oxidative stress. Here we expressed human
cytochrome c in E. coli and purified it to homogeneity with a yield of 10... 阅读全帖 |
|
b******y
发帖数: 627 | 26 My guess is as following:
he/she is purifying membrane proteins (or protein complexes). Proper
interaction with detergent is required for its solubility and homogenous
behavior. Otherwise, it is death penalty for crystallization.
If using centricon or amicon, the protein sample will be overly concentrated
at the bottom of the tubes, so will be the detergent. In this case, it
might be over its critical concentration and therefore is likely to form
micelle (I don't have problem with michelle!). At... 阅读全帖 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 27 咳咳，你这个还是说的不够吧。这样说吧，clone的保证homogeneous,
transcient的保证和原来的细胞相似，你自己想要哪个就用哪个吧。都
想要就都做，或者多做几个clone
know
2 |
|
e*******e
发帖数: 1837 | 28 For African-American, the proportion of African/European ancestry could vary
significantly among individuals. You can label them as a population/group,
although genetically they are not homogenous. |
|
y**u
发帖数: 7459 | 29 too round and homogeneous in shape though, lipid droplets? considering that
it' s 3T3 |
|
l*******e
发帖数: 170 | 30 有前途吗？未来发展走向如何？
牛PI们纷纷挺进是出于什么动机？
代谢方面的人才是不是不够（几年前metabolism可是人见人烦的东西）？
癌细胞对代谢途径的利用是heterogenous，还是相对homogenous？ |
|
l*******e
发帖数: 170 | 31 有前途吗？未来发展走向如何？
牛PI们纷纷挺进是出于什么动机？
代谢方面的人才是不是不够（几年前metabolism可是人见人烦的东西）？
癌细胞对代谢途径的利用是heterogenous，还是相对homogenous？ |
|
l*******e
发帖数: 170 | 32 我的感觉是大牛们对oncogene/tumor suppressor gene的研究进入瓶颈了，太多了，各
种组合就更多，再加上不同的遗传背景表型会更多，还有epigenetic lesion，miRNA
dysregulation，各种组合不计其数了。Mak上次说造成cancer的原因比天上的星星多，
>10 billion。所以这捆人现在希望不同来源的癌细胞有类似的对代谢途径的重新利用
，从而做到一个治疗方案通杀所有癌细胞。但Mak被问到是否不同的癌细胞对代谢通路
的改变也是千变万化的时候，他没有回答的很明确，有点儿虚。所以如果抓住IDH1/2和
PKM2不放就又回到从前的老路上去了。癌细胞对代谢途径的利用是heterogenous，还是
相对homogenous决定了这个领域是否有前途。Angio前途非常不明朗，Cantley的实验室
现在也是四面出击，一点不focus。 |
|
l*******e
发帖数: 170 | 33 我的感觉是大牛们对oncogene/tumor suppressor gene的研究进入瓶颈了，太多了，各
种组合就更多，再加上不同的遗传背景表型会更多，还有epigenetic lesion，miRNA
dysregulation，各种组合不计其数了。Mak上次说造成cancer的原因比天上的星星多，
>10 billion。所以这捆人现在希望不同来源的癌细胞有类似的对代谢途径的重新利用
，从而做到一个治疗方案通杀所有癌细胞。但Mak被问到是否不同的癌细胞对代谢通路
的改变也是千变万化的时候，他没有回答的很明确，有点儿虚。所以如果抓住IDH1/2和
PKM2不放就又回到从前的老路上去了。癌细胞对代谢途径的利用是heterogenous，还是
相对homogenous决定了这个领域是否有前途。Angio前途非常不明朗，Cantley的实验室
现在也是四面出击，一点不focus。 |
|
h*****G
发帖数: 113 | 34 小弟不才，最近需要从培养的beta细胞提取全部胰岛素，测胰岛素的总含量。看了很多
paper，都是用ethanol/HCl溶液提取，但是具体过程都语焉不详。有的是从组织中提取
，把组织放在ethanol/ HCl中研磨，然后离心取上清。现在我是培养皿的细胞，也需要
用trypsin把细胞detach，然后放buffer里homogenize吗？还是直接把buffer加到培养
孔了，然后取上清就可以了？希望有经验的达人不吝指教，如果有详细的protocol就更
好了。
小弟先谢了。 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 35 homogenize the heart for western, thanks. |
|
w******y
发帖数: 2504 | 36 My recipe,200ul for around 25mg cardiac tissue. Why do you want to
homogenize the whole heart? |
|
t*****t
发帖数: 773 | 37 经常有动物组织需要匀浆处理， 每次用液氮研磨 ，但太费劲。 有没有好一点的？
性价比高的更好了 。
谢谢大家 ！ |
|
|
d****i
发帖数: 2346 | 39 是不是inhibitor加的不够？或者是lysis buffer跟tissue的比例太低了？ |
|
|
n*********m
发帖数: 38 | 41 I never worked in large-scale drug screen area. First, the lab data should
be solid, no twist in their interpretation. I remember that a big pharm (
Amgen?) found that only 5-6 chemicals showed some kind of effects from a
final most potential list of a large screen of chemicals that had been
claimed effective in publication.
The reason why drug is effective is that it is toxic. In toxicology, we
consider anything with toxic effect, depending on concentration and dose.
I think that, for any dru... 阅读全帖 |
|
g****0
发帖数: 425 | 42 主要用于提小鼠样品的蛋白，能同时提多个样品的最好。不知道用beads的怎么样，能
否推荐一个？ |
|
w****o
发帖数: 781 | 43 目前的protocol是切一小块tissue放到lysis buffer里homogenize，超声，冰上裂解之
后离心取上清测蛋白浓度。存在的主要问题有两个：一是tissue里的脂类成分离心完会
在上面漂着，很难除干净；二是在取tissue的时候有时会混有血导致最后得到的不同
sample的lysate颜色不一致，干扰浓度的测定。请问大家有什么好的经验解决这两个问
题？或者有没有更好的protocol？目前主要在提取mouse mammary gland的tumor
tissue，非常感谢！ |
|
w*******d
发帖数: 396 | 44 我试过下面的方法。材料是小鼠肝脏。供参考。
加PBS，匀浆（homogenize)，离心，裂掉RBC，加PBS，离心，用PBS洗一次，这时的上
清不再是浑浊的了，用RIPA buffer裂解细胞，离心，收集上清，BCA测蛋白浓度，
normalize. |
|
m******g
发帖数: 467 | 45 Science 14.04.18
推荐：
1. Ancient DNA Holds Clues to Gene Activity in Extinct Humans
Reconstructing the DNA Methylation Maps of the Neandertal and the Denisovan
harnessing the natural degradation processes
of methylated and unmethylated cytosines
unmethylated cytosines decay with time to uracils
methylated cytosines decay to thymines
小知识：
1. Sleep Tight, Fly
sleep pattern characteristic of youthful flies is critical to brain
development
2. Changing Assemblages
Assemblage Time Series Reveal Biodiv... 阅读全帖 |
|
s****9
发帖数: 932 | 46 想起当年的自己了，那时候刚刚rotation，什么都不懂，也不懂得实验要设计的小小的
，大试验通常都不work。结果晚上做试验搞到夜里，把隔壁实验室老板的homogenzer搞
坏了（当时盖子没有盖紧，结果机器运动的时候，把盖子崩坏了）。
当时夜里2点，我吓坏了，紧张的不知道怎么办。大家都回家了，我只好打电话给我爸
。我爸说赶紧回家睡觉吧，大不了赔钱。我当时google发现那个homogenizer要4万欧元
（当时欧元比美元值钱）。
那一整晚我一分钟都没有睡着（一点不夸张）。第二天一早7点，我在老板门口等老板
上班。老板听了，很轻松的告诉我，没事。我现在都记得他的第一句话，“只有做实验
室的人才会搞坏机器”。听说我没怎么睡，告诉我赶紧回家睡觉，机器他赔。最后隔壁
老板打电话给公司，公司免费给了一个新盖子。
我当时就因为这个，rotation完义无反顾的join了那个实验室。那个时候也没有女朋友
，经常一周工作70小时以上，最后发了4篇一作，毕业完我还在实验室留了9个月帮老板
renew了R01. |
|
A******y
发帖数: 2041 | 47 Culture cells, treat, and harvest the cells (if attach cells, do a quick
wash on the plate). Homogenize the cells and do a organic extraction. Get
rid of the organic solvent then you can do LCMS on the extract. |
|
|
z*****n
发帖数: 444 | 49 铁的塑料的都用过，不错
Blender
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6 |
|
a***y
发帖数: 19743 | 50 这个比其他beadbeater有什么明显优势吗？
Blender |
|
