p**i
发帖数: 3525 | 1 连到 beads上的protein总是必须可溶的吧，把抗体从上洗下来用的glycine吗? |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 抗原没有必要连到bead上。
除非你说的是纯化步骤或者下游其他应用。
但是对于单抗而言，根本不需要用抗原纯化
（因为细胞只产生一种抗体）
用普通的protein A/G bead 就可以了。
我们是用pH3.5 Tris-Glycine 洗下来的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 3 If the sequence contains nothing but glycine, then it is possible it will be
degraded after synthesis or get secreted because it is too hydrophobic
and will tend to aggregate.
cells
Western |
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u**s
发帖数: 384 | 4 这是蛋白胶的图，两张都是100V的，可能是造成带比较宽的原因之一，loading是20微
升，但是之前用200V也不清楚。ladder是7-175 kDa,biolabs,tris-glycin 175 mini-gle lanes。
谢谢前面的指点！ |
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x*****e
发帖数: 309 | 5 复习生化实验小册子吧，具体原因还真忘记了：大概得研究为啥选 6.8 和8.8， 为啥
选Glycine缓冲体系什么的？ |
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C***Y
发帖数: 61 | 6
from
beads
吗？
Here are the details:
Incubate 1at Ab with beads for 1 hr at RT. Wash away the unbound Ab.
Crosslink Ab to beads with Imidoester
Crosslinkers (Pierce). Incubate Nuclear extract (or whole cell lysate) with
beads-Ab.
After washes, elute the co-purified protein complex with low PH glycine
solution instead of boiling beads. |
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v***a
发帖数: 1242 | 7 非常感谢
还有2个问题：
1）你是用什么buffer来incubate 1st Ab 和 beads的？跟wash一样的buffer吗？我
wash是用IP lysis buffer。你会preclean nuclear extract/cell lysate吗？
2）low pH glycine solution具体是多low？6.8？这个是可以直接elute然后
centrifuge了就可以上样跑胶？
with |
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C***Y
发帖数: 61 | 8
PBS or washing buffer can be used for incubating Ab with beads;
I have never done preclear;
Glycine solution (pH~2.8) can be used for elution. After elution, add equal
volume of 1 M Tris, PH7.5 (for
neutralization) and equal volume of 3 X SDS loading buffer. |
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c****e
发帖数: 188 | 9 use glycine-coated plate.
when wash cells or change medium, be super gentle. |
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F******y
发帖数: 1988 | 10 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
最好，没有的话讲讲实验tips也好。
包子奉上，小生在此有礼了。 |
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F******y
发帖数: 1988 | 11 做过了
一般用的是Tris-glycine buffer system |
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c******y
发帖数: 148 | 12
1, 1-2hrs
2, fermentas prestained PAGE ruler google
3, Running, big gel constant 70V overnight, transferring as Tris glycine gel
4, PVDF or NC |
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T**********t
发帖数: 1604 | 13 10%的胶跑11kD的蛋白不太合适吧。用Bis-Tris或者Tris-Glycine的梯度胶应该也能分
得很好的。 |
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E*C
发帖数: 1629 | 14 谢谢各位的回复.
是我没叙述仔细,请见谅.
我要检测的酶是血浆中的某种serine 蛋白水解酶,血浆中类似的酶很多.我现在知道的
就5种.我的短肽里面 有6个HIS(是连接片断,我写第一帖时没算进去) 和6 个GLYCINE,
血浆中是否有识别这些位点的酶,我还不清楚( 请大家不要BS我) 其他的有丝氨酸,异亮
氨酸,谷氨酸和精氨酸. 都可能被非特异切割.
我的酶识别位点主要是精氨酸和它前面的甘氨酸,这个在我合成片断的中间.
这回说清楚,各位看看是不是更无解了?
多谢 |
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E*C
发帖数: 1629 | 15 多谢，
我确实看到另一个底物里含 proline。
btw ,glycine 是不是没有什么酶能切呢？ |
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E*C
发帖数: 1629 | 16 多谢，
我确实看到另一个底物里含 proline。
btw ,glycine 是不是没有什么酶能切呢？ |
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f*********r
发帖数: 1233 | 18 这是个典型的例子，即便别人给了protocol，仍然不能重复。
几点建议：
1，DNase能不用就先不用。
2，loading buffer里先不要加bromophenol blue。或者不要加太多。至少要清亮，能
看到里面是透明还是混浊还是沉淀。
或者可以先用lysis buffer，处理完了再加浓缩的loading buffer。
3，pellet加上lysis buffer以后，不要用pipette打匀。而是直接用sonication冲击。
sonication是很强的，别说一个pellet，就是坚韧的大块骨骼肌组织，都能轻易打碎。
确认pellet被彻底打散并溶解了。
4，打碎以后离心，如果不理想可以考虑超高速离心。
5，取上清（这个时候应该一点都不粘了），加loading buffer，煮，跑胶。
6，如果条带形状扭曲，可以考虑把running buffer里面的tris含量酌情加量（2-3倍，
只要低分子量的蛋白仍然跑得开，跑不开的可以用4-20%的胶）。
7，如果还不太理想，可以考虑弃用glycin running buffer，改用taurin running
buff... 阅读全帖 |
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s*********a
发帖数: 24 | 19 要合成proline-glycine-proline的短肽。
哪个公司比较合适。 |
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C******r
发帖数: 790 | 20 我也是约来越不会做western了
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍... 阅读全帖 |
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C***l
发帖数: 2625 | 21 当年我们给一次性称量皿底下写上NaCl, Agarose，Glycine, SDS等，反复使用。自己
配的电泳液也至少用两次，相机和分光仪全部靠蹭。好在老板买酶和抗体从不手软。 |
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a*****s
发帖数: 838 | 22 要准备sample loading buffer, 需要考察的蛋白pI是5.17，loading buffer里加
bromophenol blue没关系吧？
准备电泳的条件是电泳buffer pH 8.0-8.3的tris-glycine 溶液
谢谢~~ |
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a*****s
发帖数: 838 | 23 用这个stock buffer按照常用的配方来配胶的话，bis-acrylamide的浓度要比平时高10
倍。不知道这个10倍高的浓度是什么原理？另外配出来的胶，颜色瓷白瓷白的（
resolving gel)。硬度没怎么增加，还是软的。就是操作起来不太爽。另外加上正极池
里加了sodium deoxycholate，跑胶的时候有一条白线跟着dye的线在一起。
还有一个问题是，不容易控制跑胶的样品速度。有的lane快，有的lane慢。郁闷。
（这个是invitrogen的tris-glycine胶的配方，用来跑native gel的）
有经验的吗？谢谢~ |
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w********r
发帖数: 1431 | 24 1.wash cell twice with PBS
2. incubate with DSP/DMSO/PBS solution for 20min at RT (freshly!!! prepared
DSP,2.5mg DSP-->480ul DMSO-->12ml PBS, final 200ug/ml DSP)
3. wash 2XPBS
4.incubate 5min with 50mM Glycine/PBS
5. wash with PBS
6. harvest cell in RIPA buffer with PIM, w/o DTT!!!， followed by CO-IP. Wash stringently with RIPA before WB.
Good luck! |
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t****p
发帖数: 1504 | 25 不知道本版有没有人有抗体纯化的经验。
血清过抗原柱，用PH2.5的Glycine洗脱，最浓的几管fraction沉淀出来了（管子有加1M
Tris buffer），形成浑浊液，无法重新溶解 （调PH，加盐都无效）。
溶解问题不解决没办法dialysis，抗体放4度时间长了估计也有问题。哪位知道trick赶
快指点一下，包子相谢！ |
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l*****r
发帖数: 131 | 26 楼上说得对，关键看你的抗体是不是在可溶部分。如果沉淀的是你的抗体，不妨试试2M
Arginin pH4.3，我试过洗脱效果比pH2.5要差点，但还行。另外还有个idea，如果BSA
在Glycine里不沉淀的话，加点BSA试试。如果这个办法可以能给我发个消息吗？祝好运。 |
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c******y
发帖数: 148 | 27 对于PVDF膜，
glycine 15g, HCL 调pH 2.2
sds 1g
tween20 10ml
定容至1L
取200ml，80C 水浴 30min左右取出，shaking至室温
用清水冲洗膜几次后，可以放下个抗体 |
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n******5
发帖数: 21 | 28 我觉得M-beads, 主要是方便，和 minimized carry-over therefore increase
recovery. if you want to minize non-specific interactions, try follow some
naked beads to absorb them.
但是缺点就是 binding capacity 很低。
Wash buffer:建议加一些non-ionic detergent, like Triton100
Elution buffer: SDS+boil will get everything off, but all in denatured form,
it is perfectly fine if you directly go on to SDSPAGE.
if you want to maintain functional activity, I would suggest using low pH
elution (Try pH2.0 glycine, use Tris-pH8 to neutra... 阅读全帖 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 29 我们实验室跑native gel用的都是Tris-Glycine buffer，用TBE跑不动，我也不知道原
因，但是TBE就是跑不动。
upper band强度增加是应该的，但是bottom band应该相应减弱才对。因为你每个孔加
的RNA量是一样的，所以上下band的强度加起来应该是恒定的。你每次跑这个胶都会这
样么？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 30 也来凑个热闹问个问题
+Tag的情况下大家喜欢加Poly glycine linker么？
有的说法是+ Linker可以minimize Tag的side effect
但实际上+linker的人似乎也不多…… |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02020104
Substances compatible with the Thermo Scientific Coomassie Plus Protein
Assay. The following is a short list of compatible substances and their
concentrations that the BCA Protein Assay can tolerate. For a more complete
list please refer to the instruction booklet for the product or view our
Table of Compatible Substances for a comparison of substance compatibilities
among several different protein assay methods.
Substance Compatible Conc. ... 阅读全帖 |
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w*******d
发帖数: 396 | 32 Aerosol therapy with thiamphenicol glycinate: a retrospective study on
efficacy and safety in a group of sixty-six oncological patients.
Macchi A, Terranova P, Macchi S, Roselli R, Castelnuovo P.
Int J Immunopathol Pharmacol. 2011 Jan-Mar;24(1):189-93.
Title
Aerosol antibiotic therapy in children with chronic upper airway
infections: a potential alternative to surgery.
Authors
Macchi, A.; Castelnuovo, P.
Journal
International Journal of Immunopathology and Pharmacology 2009 Vol. 22
N... 阅读全帖 |
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o*****r
发帖数: 156 | 33 ???
glycine is not chiral, and all 19 others are L- in most cases. |
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S******e
发帖数: 393 | 34 传统方法，1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol，
另外可加可不加SDS(0.2%)。
我一般40伏过夜，nitrocellulose membrane。
另外，也不一定是western问题，首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了，
做个瞬转吧，250kD 不太难，我做过这么大蛋白瞬转的，做western也检测到了表达。 |
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a***c
发帖数: 960 | 35 我也有楼主说的问题，是不是buffer有问题呢？
我用的是Towbin buffer（25 mM Tris, 192 mM glycine (20% methanol)），Bio-Rad
的机器，测了buffer的pH8.5，似乎没有问题。
你的buffer配方是什么？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 36 大家参考一下。其实我是没有精力做的，有人成功的话给我acknowledge就够了。
找你要研究的基因的BAC，然后再E.Coli里面通过homologous recombination在
有兴趣的片段（当然要比较长的）两头加rare的RE site或者ZFN一类的，随便折
腾；里面再加点strong的aptamer, 或者变态点，加一堆lacO.
这玩意儿做成转基因IPS或者ES，好处是可以多copy, 十个八个没问题吧，更多
应该也行吧? 然后做成转基因小鼠，取你有兴趣的特定组织，或者细胞培养，
做ChIP的前面部分就是fix，洗掉细胞质，然后instead of sonication, 用RE
一顿乱切，配合aptamer purification. 你可以先size select然后affinity,
或者先affinity然后size select, 或者几种不同的方法series affinity，
anyway, 拿到东西decrosslinking上ms spec, 当然前面crosslink的时候不能
用glycine quench.
这个思路欢迎大家补充。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 37 我安全起见，在这个tag和我的蛋白间+了8个glycine做linker，因为问题不大吧？ |
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c********b
发帖数: 363 | 38 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 39 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 189 | 40 1） crosslink your antibody with the beads
2) elute with 0.1M glycine(pH 2.5) |
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L*******e
发帖数: 2153 | 41 I am planning to prepare coIP samples and use mass spec to get a protein
binding profile. By comparing control and mutant groups, I am hoping to
find targets that are more disease relevant. I use magnetic beads for Co-IP.
Now here comes the questions:
Would it be good enough to just use SDS buffer for elution? I know this is
the case if my next step is western blotting.
If not, would an acidic glycine buffer followed by a basic buffer (Tris-HCl
) be sufficient since this only results elution o... 阅读全帖 |
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C******2
发帖数: 97 | 42 1,加个HA试试。
2，可以考虑用GLYCIN洗脱，感觉比3*FLAG好，特别是如果你已经用了3*FLAG构建了表
达载体。也可考虑用ARGININE洗脱。
搭车问个问题，有人做过非人类细胞的MS吗？具体的难点在哪里，DATABASE的不足？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 43 福尔马林fix tissue，切片，觉得背景荧光挺多，
请问如何降低呢，google结果有用NaBO4或者Glycine的，大家的经验哪种比较有效？
另外请问可不可以用软件来减去背景荧光，可以用photoshop做吗？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 44 我先给几个我从文献上看来的linker总结：
很早就有人用十个alanine做linker，后来有人用十个glycine-alanine重复做linker，
再后来有人用flexible亲水linker（GEGQGQGQGPGRGYAYRS），公司卖的载体有GGGGGA做
linker的。
有谁用过的谈谈经验？谢谢 |
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W****7
发帖数: 426 | 45 细胞自发荧光很正常，我觉得如果你做荧光定量的话可以不用理它，就选几个背景细胞
subtract掉就行了。
最简单的方法就是把你的激发光强度降下来，当然这个只能降低一些自发荧光估计不会
一点都没有。
听说有人用一些filter能降低background，我不知道怎么用。
其他常用的方法有Glycine，CuSO4，NaBH4，ammonium salts和苏丹黑等一些染料，
具体方法自己google一下吧。 |
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l********s
发帖数: 70 | 46 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616 |
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n***w
发帖数: 2405 | 47 搭车问一下，最近在转差不多300kD的蛋白，用湿法转，
试了几个条件，
1. CAPS transfer buffer (10% MeOH), PVDF (precast gel), 400mA 1 hour. 结果是
ladder的top 4 bands 还留了相当一部分在胶上，胶也开始变形了，但是immunoblot还
是能出来不少蛋白。
2. 3 都是改变电流和时间，结果还是会有ladder在胶上。
4. tris/glycine transfer buffer, no MeOH, 转的时间差不多，Ladder也没有全都过
去，虽然也能image出来需要的蛋白，虽然有点弱。。。
版上有经验的建议是湿法30v转overnight? |
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m**********n
发帖数: 299 | 48 MEYER M. HARRIS; ERWIN BRAND. Metabolic and Therapeutic Studies in the
Myopathies WITH SPECIAL REFERENCE TO GLYCINE ADMINISTRATION. JAMA. 1933;101(
14):1047-1052.
please send to
t*****[email protected]
thanks |
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j********r
发帖数: 156 | 49 碰巧刚看到几篇关于氨基酸代谢的文章，大牛来点评一下。
1. Serine starvation induces stress and p53-dependent metabolic remodelling
in cancer cells （nature, 2013)
2. Serine, but Not Glycine, Supports One-Carbon Metabolism and Proliferation
of Cancer Cells (Cell reports, 2014)
3. Phosphoglycerate dehydrogenase diverts glycolytic flux and contributes to
oncogenesis (Nature genetics, 2011)
4. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential
in breast cancer (nature, 2011)
elife刚发了一片关于metformin的文章。俺愣是没看... 阅读全帖 |
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b*********0
发帖数: 4 | 50 1. 那个70多kD 是根据amino acid sequence推算出来的理论值，不是真正在gel
migration上的位置。
2. 同样的蛋白用同样的ladder在不同的gel(invitrogen bis-tris, Bio-rad Tris-
glycine 系统上跑出来的都可能差10kD左右。）
3. MS给出的结果一般是比较靠谱的，尤其是SC（spectrum counts, e.g., sequenced
times）
4. 如果能弄到相关抗体的话， 可以做个western就可以确认了。 |
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