f******k
发帖数: 856 | 1 我这个问题很奇特，我用Invitrogen的dynabeads做ChIP-seq，最后拉下来的DNA量总是
比较高，做qPCR也没有enrichment，但是用同样的protocol，换回agarose beads，就
很少碰到这种问题。这不合理啊，dynabeads按理说背景要比agarose beads低很多才对
啊？！不知道大家有没有碰到这种情况？我试过好几种洗的方法和试剂，比如最常用的
就是低盐洗一次，高盐洗一次,LiCl洗一次，TE洗两次。也试过用RIPA洗过，也试过大
量延长洗的时间，但是最后elute下来DNA的量还是比较高。
另外，能不能请推荐一个比较好的做转录因子ChIP-seq的盒子或者详细的homemade
protocol？我做的这个转录因子，比较low abundant，可是我的材料是primary tissue
，又没法一次拿到很多的细胞（一次运气好的话可以有50-100million）。看有的文章
说现在10million就可以做转录因子的ChIP-seq了，可是我从来没成功过。现在真是快
被逼死啦。。。。快救救我 ：（ |
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y******8
发帖数: 1764 | 2 Dynabeads is good for IP.
I also tried Protein A/G magnetic beads from pierce. They worked well. |
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g******t
发帖数: 230 | 3 抗体最重要，对好的抗体， Dynabeads 也就是锦上添花。对某些抗体，Dynal 的
binding 非常弱，结果还不如agarose beads (in my opinion, invitrogen oversold
it)。
不知道你有没有试过mix agarose A and G. |
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T********t
发帖数: 280 | 4 I am using the Dynabeads/Protein A for ChIP/ChIP-seq, it works very well. |
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k*****n
发帖数: 323 | 5 try washing your Dynabeads with PBS 0.5% BSA 3 times, then incubate
antibodies in PBS-BSA for two hour. After IP, make sure resuspend beads
totally during each washing step. I never using sperm DNA. I would suggest
you using Pol II monoantibody 4H8 as positive control. Several steps are
critical for ChIP, 1, crosslinking, always using fresh FA, like 16% FA from
Thermo. for cells 15 min crosslinking with rotation would be enough, quench
with 0.125 M glycine for 1 min. 2 sonication, try Branson so... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 6 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: dynabeads (dynabeads), 信区: Biology
标 题: 转XYS：上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁多篇论文图片造假
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Aug 5 12:00:39 2018, 美东)
上海交大，呵呵
◇◇新语丝(www.xys.org)(newxys.com)(xys10.dxiong.com)◇◇
上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁多篇论文图片造假
上海交通大学医学院附属仁济医院的洪洁多篇论文存在图片造假。
（1）洪洁以第一作者发表的Cancer Research论文(Bile Acid Reflux
Contributes to Development of Esophageal Adenocarcinoma via Activation
of Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase Cγ2 and NADPH Oxidase
NOX5-S)，图5B和图4B使用了相同的凝胶电泳图片，是刻意修饰之后试图作为不
同实验结果。而图6... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 要把target protein conjugate到beads上用于下游的separation。现在在试
dynabeads，发现conjugation efficiency远低于预期值。而且比较头疼的是
要测出真实efficiency也很tricky。间接测反应后溶液里剩多少protein很
不准。
请高手指教有没有efficiency比较高的beads？最好是magnetic的（是不是
只有dynabeads系列？？），其他的介质也可以。最好是covalent linkage，
biotin-avidin的也行。BTW我的target protein pI在5~6
非常感谢。 |
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g*******f
发帖数: 427 | 8 最近在做一个转录因子的 ChIP, 用的是 Richard Young 的protocol, 可是 IgG IP 的
在有的sample总是有很强的信号，当然也有的 sample IgG pull down 下来的很弱的。
我想请教一下如何降低这种non/specific binding, 我用的是 invitrogen dynabead。
以前用过 millipore agrose bead ,记得 agrose bead 要用 salmon sperm DNA block
的，我想请问一下有没有人用salmon sperm DNA block dynabead。 问过 invitrogen
technical support，他们不推荐，但是也说不出个理由，只是没有人这么做过而已。
如果有人试过不行，那我也就不必试了。多谢 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 9 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 10 dynabeads你是按照protocol来做的吗？dynabeads work great for me. |
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m*********k
发帖数: 10521 | 11 成功奖励 20 伪币的用户:
asan, bjjasmine, bonymb, caibao, cnca, dilse,
dora123, dynabeads,
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奖励版面:(Movie)2... 阅读全帖 |
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a********c
发帖数: 3657 | 12 新胎记得加dynabeads，一辈子不用balance |
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c**d
发帖数: 3888 | 13 I suspect wheel balance is off, too.
Try dynabeads. |
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E****A
发帖数: 184 | 14 How about their mRNA isolation kit like Micro-FastTrack 2.0 kit? and
dynabeads direct mRNA isolation kit? |
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 哦，我没比较过，因为我一般不需要把结合上去的蛋白再洗下来。
我就是看说明书上这么说的：
2.2 Release of Immobilized Biotinylated Molecules
The biotin-streptavidin bond is broken by harsh conditions. 5 mins
incubation at 65°C or 2 mins at 90°C in 10 mM EDTA pH 8.2 with 95%
formamide will typically dissociate >96% of immobilized biotinylated DNA.
Alternatively, boil the sample for 5 mins in 0.1% SDS for
protein dissociation.
Please note that proteins will be denatured by such treatment and Dynabeads
Streptavidin can not be re-used.
It has al |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 有没有什么宝典推荐阅读？
我要做的实验，希望能conjugate a few ug protein to beads (dynabeads, etc)。
要求是用量越少越好（protein贵啊～），在此前提下beads coverage越高越好，
有什么product可以推荐？conjugation完成后如何定量？lab里用nanoorange，据说
效果很一般。
最后，lab用NHS-EDC link primary amine，有什么alternative吗？我指link蛋白
上其他位点。
非常感谢！ |
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E****A
发帖数: 184 | 17 请大侠推荐好用的。不要invitrogen的dynabeads kit系列，rRNA残余太多。
多谢! |
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j******o
发帖数: 151 | 18 看到公司有关于antibody coupling kit的说明,但是搞不清楚对antibody的具体要求是
什么,难道是什么样的monoantibody都可以用于这个方法么?请有经验的同学指点一下,
谢谢 |
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w******e
发帖数: 1187 | 19 应该就是biotinylation＋streptavidin beads吧？那是个protein就行 |
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y*****1
发帖数: 73 | 20 you have to biotin label the antibody (or peptide) you want to use |
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l****y
发帖数: 398 | 22 if it is epoxy bead, you just incubate the bead with the anitbodies
overnight. |
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z****g
发帖数: 3340 | 23 有个东东叫Dynabeads from invitrogen, you can order protein A or G beads.
Good luck.
cruz的
A |
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d****7
发帖数: 109 | 24 我用过salmon sperm DNA block dynabead，没有任何效果，至少in my case，没有任
何效果，BSA block足以
IgG信号强莫非是Buffer contamination?我以前也出现过IgG信号强，然后重新prepare
所有buffer,就好了
block
invitrogen |
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d****7
发帖数: 109 | 25 IgG本来就不是什么好的control，我们做ChIP时，不仅用IgG，还用negative region
primer做control
对于ChIP下来的DNA，这个跟你的蛋白的表达量，IP的细胞数有关，比如我的TF表达量
很低，我用20碟10cm dish才ChIP下来10ng DNA，如果是histone的话，估计会很多。
对于Protein G，我这有个鼠单抗，是IgG1，与protein G结合的一点也不好，必须用另
一种beads，叫Pan Mouse IgG Dynabeads，这个beads是pre-conjugated human
monoclonal ab to mouse IgG，结合的不错。但让我费解的是，同样是鼠单抗，同样是
IgG1，Flag M2抗体就和Protein G能perfectly结合。
Rabbit |
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t*****z
发帖数: 1598 | 26 多谢dynabeads ，我也改用mini的试试吧 |
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d****7
发帖数: 109 | 27 嗯，能，连上反而更好，我用Sigma V5-10 Mouse monoclonal Ab，这抗体是IgG1，与
protein G结合拒差，我就用DMP把V5定到protein G上，然后IP效率奇高。
后来我不想每次做IP都crosslink，所以就换了一个beads，叫Dynabeads Pan Mouse
IgG，这个beads能与各型mouse IgG的Fc段结合，结合力很高，不是做广告，确实不错。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 28 btw, dynabeads proteinG From Invitrogen. |
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k****o
发帖数: 589 | 29 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP，要沉淀的是一个膜受体。用的抗体
（兔IgG）应该没有问题，因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和
Protein A交联。用了300～400 ug total protein沉淀，4度翻转过夜。之后清洗用的
是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱，收集了3个组分。可
是之后用SDS-PAGE+WB检测，受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问
可能原因有哪些？
另外Seize X的kit刚好用完，有没有什么其他的kit便宜质量又不错的？曾经考虑过
dynabeads，但是貌似还得另买一台磁力沉淀器？
多谢！ |
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n********k
发帖数: 2818 | 30 my exp failed miserably when my dynabead from Invitrogen was accidentally
frozen in a 4 degree fridge...but I am not sure though as it wasn't not a
well-controlled experience:))) |
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w***y
发帖数: 493 | 31 我现在正在尝试从zebrafish embryo的total RNA里面提取mRNA， 用的是invitrogen的
Dynabeads和他们的mRNA purification kit。 按照他们的protocol做完后跑胶发现里
面还是有挺多rRNA。上网搜了一下发现有的人建议连续做2次protocol里说的
purification。 请问大家有什么建议么？
我试了一下发现第1次纯化后获得了大概3.8%的total RNA。第二次以后有1.5%的total
RNA。我不太确定这样连续2次purification会不会损失太多mRNA。 |
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l******d
发帖数: 2186 | 32 agarose beads以前也用过，效果不是特别好，有没有人有什么好方法？包子奉上 |
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l******d
发帖数: 2186 | 35 谢谢大家乐，坚定了我买这个beads的决心！！！ |
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y****y
发帖数: 123 | 36 我是用的dynabeads
只降pH的话什么都溶不出来好发愁 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 37 you can try Dynabeads
i.e.
PMID 22991688
Denisin AK et al.
Post-collection processing of Schirmer strip-collected human tear fluid
impacts protein content. (2012).
Analyst. 137: 5088-96.
recombinant human lysozyme 14 kDa, pI=10.2–11
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22991688 |
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g*******f
发帖数: 427 | 38 我最近在做一个蛋白的 SUMOylation, 用SUMO1(D-11)(SC5308,santa clus) 来IP,然后
用我要做的蛋白的抗体 blot,用的是 Dynabeads Protein G. 但是 没有任何 SUMOed
蛋白的带，但是比我的目标蛋白size 小的位置有一条很浓的带，我怀疑是从beads上
elute 下来的东西，会不会是IgG呢？
附图从左到右 lane 1－4： 不同处理的样品 用SUMO1 IP后用目标蛋白抗体blot; lane
5-8 是相应的 input; lane 9-12 是ip 后用 bead collect 后的 leftover。
从图上看IP 的样品在目标蛋白的位置没有任何带，但是下面很强的band 不知是什么？
不知是否是这个影响了 IP，如何消除掉这种非特异性。
还请对 SUMO 有经验的大小牛们不吝赐教。多谢 |
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C**1
发帖数: 57 | 39 我将靶基因与Strepdavidin tag 融合表达质粒转染在293T细胞，然后准备通过蛋白免
疫沉淀方法找到与靶蛋白相结合的蛋白复合物。第一次做这个实验，想问问有经验的用
哪个公司的Streptavidin beads效果最好？Perice 的还是invitrogen的Dynabeads&#
174; M-280 Streptavidin？谢谢！ |
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x*********a
发帖数: 24 | 40 一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
buffer， NP-40的浓度时1%。
immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
dye 90度10min中，然后跑胶做western。
wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
含 25 mM Tris-HCl, 5 mM glycerophosphate, 2 mM DTT,... 阅读全帖 |
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f**********r
发帖数: 95 | 41 那要看你的要求了。这个kit貌似只有MS column, 如果细胞太多就不行了。另外，
Meltenyi的磁珠是一直结合在细胞上的，对有些实验可能会有影响。如果需要把细胞从
磁珠上release下来，可以考虑Dynabeads FlowComp Kits. 另外Stemcell Technology
也可以看看。 |
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f**********r
发帖数: 95 | 42 酸洗应该比有磁珠结合在细胞上更concerning吧？Dynabeads FlowComp Flexi Kit可以
用自己的抗体。 |
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J**a
发帖数: 215 | 43 多谢建议，我是用protein G/Ab conjugated dynabeads，不过我的negative control
用了一个irrelavent的抗体（不和任何已知蛋白有相互作用）。做出来的RIP结果rna浓
度比真正的ip实验低很多。请问有啥降低background的方法么，或者啥beads更好？ |
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g*******f
发帖数: 427 | 44 我想用一个蛋白的抗体来免疫沉淀这个蛋白，目的是要从组织中富集这个蛋白用来做质
谱看它的在体内的修饰情况。
我用抗体沉淀蛋白后，加dynabeads protein G,洗脱后跑western blot 看蛋白有没有
被沉淀下来。western blot用做IP的抗体检测，发现在55KDa有非常强的带，但是我的
目的蛋白是40KDa, 这个带应该不是protein G，因为protein G 只有17 kDa。 我想请
问这个带会是什么呢？用什么抗体做western blot 来检测这个ip 后的产物比较好？
多谢了 |
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m******5
发帖数: 1383 | 45 ChIP-Seq 就是agroase beads好用稳定
我也不知道为什么。也曾经有和你一样的问题，后来决定不折腾了，结果能用稳定就行
tissue |
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f******k
发帖数: 856 | 46 我也是折腾了好久，打算放弃磁珠了。那请问用agarose你是如何解决salmon sperm干
扰测序的问题呢？当然可能你不用salmon sperm DNA blocked agarose beads? |
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m******5
发帖数: 1383 | 47 买一套好点的kit就不用想这些事了
salmon sperm其实蛮好，反正也map不上 |
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k*****n
发帖数: 323 | 49 For Seq, don't using any sperm DNA! it will saturate majority of your reads,
although it won't map to your genome!
for qPCR it might be fine. |
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d***s
发帖数: 1062 | 50 收藏了。
用过diagenode的kit还不错，就是manual写的不是很清楚。不知道有没有更新过，好在
客服不错。 |
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