C****n
发帖数: 79 | 1 最近在用DAPI染丝状真菌的细胞核，步骤完全是照着教科书或者paper做的。突然发现
DAPI可能会导致细胞核破裂，造成了严重的fake结果。
比如without DAPI staining, 用显微镜观察NLS-GFP是细胞核定位的；但是在DAPI染色
（10min）后观察，GFP的定位变成 cytoplasmic了。然后我做了一个time elapse的实
验，很诡异的发现在某一个时间点细胞核突然间破裂了，定位在细胞核里的GFP突然
distribute to the entire hyphae。
请教各位大虾这是因为DAPI的毒性照成的吗？因为sample比较多，实在不想fix以后再
immunostaining 观察，除此之外有什么好方法吗？十分感谢！ |
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C****n
发帖数: 79 | 2 恩，谢谢，我也注意到了Hoechst这个dye了，正在计划中。
可能是各种细胞膜的通透性不一样，所以DAPI浓度有区别，有些需要很高。 我用的
DAPI浓度倒是不大（0.2ug/ml）。我试过植物protoplast，这个只有细胞膜的植物细胞
通透性很差，DAPI基本上进不去。所以我对Wiki的理解是对于某些细胞也许需要很高的
DAPI浓度。 |
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L****S
发帖数: 76 | 3 Dear all,
I got another problem for Image J. My boos asked me to score TUNEL staining
for apoptosis, that means I need to score almost 1000 DAPI (nucleus) to see
among them how many TUNEL positive cell according to her. That is a lot of
scoring under microscope.
I wonder whether I can take images and use Image J to score DAPI (I just
need to score TUNEL).
Is there anyone knows how to use Image J to score DAPI?
Thank you.
Lei |
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q******g
发帖数: 3858 | 4 好像一般用Hoechst
https://en.wikipedia.org/wiki/DAPI
DAPI can be used for fixed cell staining. The concentration of DAPI needed
for live cell staining is generally very high; it is rarely used for live
cells |
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h***e
发帖数: 232 | 5 i'm a new to this.
Just wondering if DAPI can get into live mammalian cells and stain the
nucleus? If yes, why many protocols require cell fixation and
permeabilization?
Will DAPI do anything to membrane protein if it stains live cells?
Many thanks! |
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c*****a
发帖数: 179 | 6 想做FISH，打算找个东西染一下细胞，看manual感觉DAPI和Hoechst是差不多，就是
Hoechst用量更大一些。请问从效果上说这俩东西哪个更好呢？ 谢谢啦 |
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p*******r
发帖数: 4048 | 7 DAPI is way easier. But Hoeschst stains slightly different thing, so depends
on what you want... |
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b*****l
发帖数: 9499 | 8 赞 boos :)
建议先用 DAPI image 来做 thresholding 找出每个 nuclei，可能还需要做
segmentation 来区分开相邻的 nuclei，这个用 watershed 比较好。然后用 nuclei
的结果做 mask 来处理 TUNEL 的图像（如果背景干扰比较大，而且背景跟信号有叠加
，可以先去一遍背景），就可以得出每个 nucleus 里的 TUNEL 信号来。把这 1000+
nuclei 的 TUNEL 信号统计起来画成一个分布，然后就可以用分峰软件准确地找到两个
峰，算出面积，就可以很准确地得出 apoptosis rate。同时，也可以找到最佳的
threshold 点来分 TUNEL 信号，这样就可以把原始图上的每个细胞核都标为 pos 或者
neg。这样做的好处是根据分峰结果可以算出两类错误分别是多少。
这个流程的每一步，都是很规范很常用的工具，可以 google 到 ImageJ 的代码。不知
道有没有人集成过，反正我到最后还是懒得集成了。
staining
see |
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n**********g
发帖数: 196 | 10 同样推荐Hoechst 33324
与Hoechst 33328和DAPI相比 cell permeability提高了很多 毒性极小 适用于live
cell 当然要是染fix过的 如果用detergent 处理过了 用什么染都行 |
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n**********g
发帖数: 196 | 11 对的 33324， 33258, DAPI 都是一样的 都能用350/460nm看到 |
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i*****i
发帖数: 154 | 12 我用DAPI染的细胞核，用fluorescent microscope拍照后，现在想计数。
不知道有什么软件可以做这种计数？
ImageJ可以么？ |
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C****n
发帖数: 79 | 13 我一开始也猜测是在分裂，但后来一想，分裂不可能同步发生在所有的hyphae里。当然
也有可能是DAPI促使了所有细胞核的分裂。 |
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s*****j
发帖数: 6435 | 14 filtering your DAPI signal (mean or median, "Process"->"Filter")
threshold to mask, "Image"->"Adjust"->"threshold"
get rid of holes in DAPI. "Process"->"Binary" -< "Fill Holes"
if needed, watershed to seperate attached DAPI ROI "Process"->"Binary"-?"
watershed"
use partical analyzer to add all DAPI ROIs in the ROI manager "Analyze"->"
Analyze partcles"
use "Process"-"bianry"-> "dilate"/"erode" to get outer region of nuclear.
set parameters in "Process"->"binary"->"options" on how you want to "s... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 15 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 16 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 17 Published: 30 October 2013
Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the
ACE2 receptor
Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu,
Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji
Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi
Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak & Zheng-Li Shi
Nature volume 503, pages535–538(2013)Cite this article
Abstract
The 2002–3 pandemic caused by severe acute respirator... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 18 I try DAPI, But if scan in the same time, fitc would show DAPI pattern,
anyone know a good dye for nuclear and not overlap with FITC? |
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y***y
发帖数: 709 | 19 大家有见过mycoplasma污染之后是什么样子的吗？
我最近养的细胞在20X的显微镜下看，可以看见medium里面浮着大量的黑色细小浮游物
可是细胞生长不受影响，把这些medium转入到管子中放到室温下几个星期都看不出来液
体变浑浊啥的
我老板也曾经提到过是不是mycoplasma污染，我们没有做过专业的测试。可我土办法试
了一下，就是用DAPI染色，看细胞膜上有没有荧光信号。按说如果是mycoplasma污染，
会有很多mycoplasma附在细胞膜上，我用DAPI染色之后应该会发出荧光信号，可是我的
细胞没有。我就下了没有mycoplasma的结论，认为那些细小黑色浮游物是细胞代谢的产
物。
可看到大家在这里说的，我现在心里也打鼓了。
有谁能说说被mycoplasma污染之后的细胞是啥样子的？
project |
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S*****s
发帖数: 287 | 20 你是不是检查一下你的 FACS Buffer？ 比如PBS 的 pH 值，是 1X 还是 10X PBS，FBS
有没有过期，或者 7-AAD 买了多久了？我也用 293T 做 Flow，样品分解成单细胞后
要花六到七个小时染色，然后每个样品里加 7-AAD 做对照。我的样品里 7-AAD
positive 的细胞都不多。我在 Negative 的细胞里 gate 一部分出来作为 P1，P1 一
般都在 70% 以上，另外有一部分 Negative 的细胞 FSC 和 SSC 值都很大我都不分析
了。你这个 50-60% 听起来有点吓人。或者你换一个染料来做这个实验，比如 DAPI？
如果 DAPI 的值和 7-AAD 的不一样说明两个药品当中有一个坏掉了。
AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细
胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 21 同样的一抗拿488，568都没有问题。
就是对excitation wavelength很迷惑。
我们的fluorescent microscope上面3个filter 对应DAPI, FITC 和 TRITC。能否用
DAPI filter用于405，423？ 照理该看到蓝色或者蓝绿色的signal啊。
另外对于647，是不是肉眼无法直接看到？ |
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z****u
发帖数: 1007 | 22 同样的一抗拿488，568都没有问题。
就是对excitation wavelength很迷惑。
我们的fluorescent microscope上面3个filter 对应DAPI, FITC 和 TRITC。能否用
DAPI filter用于405，423？ 照理该看到蓝色或者蓝绿色的signal啊。
另外对于647，是不是肉眼无法直接看到？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 关键要看你的滤镜。
DAPI, Alexa 488, Alexa 546, alexa 635 or 680
或者
DAPI, alexa 488, alexa 594, alexa 680
和楼上另外一位同学推荐的染料差不多，但是我不推荐Alexa647, 因为它和Alexa 568
有部分重叠 |
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e**r
发帖数: 1144 | 24 Hela细胞，在没有血清的DMEM里培养的
DAPI染色发现细胞周边有很多部位被染色了
DIC下聚焦到顶面，发现表面变得很粗糙，这些粗糙的类似囊泡的东西可以被DAPI染色
可以确定细胞没有污染
这些东西是什么结构？ |
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K**R
发帖数: 193 | 25 我最近染5mC 抗体，按道理说应该是完全在Dapi里面。做图后，发现他们能完全merge
，但是5mC 信号面积比dapi信号面积大，请问这样正常吗？ |
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M*******C
发帖数: 183 | 26 为了检测转的效率，用带绿荧光488的CTRLsi (Qiagen 1027284, All Stars Negative
CTRLsi AF 488) 转染细胞，两天后看绿荧光，如果活细胞在PBS里，导致只能看10x物
镜，否则会接触液面，并且由于没有DAPI染核，有时难以判断看到的绿色是杂质还是细
胞. 但不懂，如果PFA固定，染DAPI，会不会影响对绿荧光的检测。问了周围两个人，
一个说不要固定，另一个说固定没问题。thx |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 以前我们在做免疫荧光的时候会在目标蛋白之外再加一个抗体来标记组织的大致结构。
如果实在没有的话至少会用DAPI. 但是最近我们要做脊髓组织的染色，但是我们对神经
组织没有任何经验。DAPI估计是不行吧，因为脊髓大部分地方都没有细胞核，有核的都
是一些外围细胞。我想过用tubulin B3 又怕信号太强到时候看不出contrast.
大家对此有什么推荐？我们想看神经组织的发炎情况。但是不能用H&E staining. 谢谢！ |
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f**o
发帖数: 12685 | 28 应该有人吼出科研工作者心中的苦闷了！ 精选
已有 11665 次阅读 2016-5-19 00:49 |系统分类:观点评述
说明：本文可能有令各位感觉不适的内容，读前要慎重。本人只从事过生物医学基础科
研，对物理、化学等其他基础学科状况并不甚了解，不知道本文观点是否适用。本文一
开始题目是：《应该有人吼出（生物）科研工作者心中的苦闷了！》后来不同的人或评
论或私信告诉我他们的学科也有这种状况，因此就把生物二字去掉了。
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前言：本文并非是为了灌输负能量，而是希望指出现行科研模式的一些弊端，引起有关
方面的重视，仅属一家之言。并非为了严格论述证明某件事，只希望读到的朋友体会一
下自己或身边的人是否也有这类经历，这类感觉，与大家交流一下。另外，很多博友也
指出了数学的重要性。我也想说，数学、计算机、和统计应该是现代自然科学研究人员
的必备技能。然而可惜的是，除了一些顶尖大学，大多数国内985高校的生物系（不知
道其他学科是否也是），仅开设了两个学期的微积分。这对于现代... 阅读全帖 |
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c********g
发帖数: 15629 | 29 那种死水一潭的稳定，只能养肥一批开跑车、挎VL、喝洋酒、逛堂天间人、手持dapi的
官僚和买办，还有他们的后代。这些人，和明末、清末的士大夫没什么区别，国家亡在
他们手里，人民跟着遭殃，还不如现在乱一乱。
看看《大纪元》《新唐人》对富士康的评价，对郭靶子肉麻的吹捧；看看《南方》羞羞答答对富士康的开脱，就知道他们是为人民说话，还是为新台币说话了。 |
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c********g
发帖数: 15629 | 30 起来了，迷迷糊糊的给我打了个电话，不断喊着ipad dapi |
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d*******n
发帖数: 3851 | 31 ☆─────────────────────────────────────☆
kinson (一戒一持) 于 (Mon Feb 7 22:04:06 2011, 美东) 提到:
感谢他能够置之死地而后生。还钱或部分还钱。
这个事情无论还不还钱，id是大受损的。
但是还钱本身就是“人性本善”的一种表现。（注意：这4个kindle是寄出去了，就是
他没骗钱。他的纠结就在于赔了钱，赔在了交易的条约上。条约是人定的，在这次事件
中是复杂的，每个人的理解有偏差。但是，基本上大家的评论就是参考了，剩下的就是
心有不甘）
这个事跟我没关系，我说感谢就是我原以为他会还钱，后来有些失望，现在证明了我的最初想法不是臆测的。
☆─────────────────────────────────────☆
yyber (忍而不发) 于 (Mon Feb 7 22:04:39 2011, 美东) 提到:
re
☆─────────────────────────────────────☆
fhxysnow (风雪) 于 (Mon Feb 7 22:04:38 2011, 美东... 阅读全帖 |
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k****n
发帖数: 8684 | 32 执法了前50个，后面的xdjm抱歉了，人穷包短。
yyber
fhxysnow
JianOu
bangab
ananpig
coolyun
LLJJ
iceg
stoneincrazy
xiangpi810
buyforsale
TLRs
papabear
liangshuai
JianOu
desktop12
lovemocca
MrDeal
canyu
xiaowoniu
gjmylove
entry
gfplplp
nickhodge
lunanight
rose930
wormsworld
denn
dapi
boster
Jasper79
friedegg
chanmaomao
xeobron
ywmin
crystalcock
anniemm
lovebeckdy
cnusmler
jiawen
soimbox
BabyRyan
pixie
guaifei
charlyking
majstock
MDM
cressida
tassel
ming2008 |
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P*********g
发帖数: 1336 | 34 我不懂摄影。我是搞显微镜的。我打个比方，你看看有没有可比性：
学术研究（主要是生物，医学等行业）用的显微镜镜头有几个档次，比如：
N PLAN
PLAN FLUOTAR
PLAN APO
N PLAN的成像aberation,以及色彩CORRECTION一般。
PLAN FLUOTAR比之高一档， 主要是设计给荧光用的，在几个主要的常用的荧光光谱区
段着重做了CORRECTION。不如DAPI, GFP, TEXAS RED的染料的EMISSION区段－－就是蓝
，绿，红等。
PLAN APO基本上是连续的白光光谱都做了CORRECTION.这样色彩是最好的。
这还只是说色彩的还原，还有各种ABERATION的纠正，比如SPHERE, FLATNESS等等。我
也是半瓶子醋在晃荡。
镜头的NA--NUMERICAL APERTURE就相当与这里的光圈。这又是一个因素，但是更色彩纠
正什么的应该是独立的。
当然，一个镜头上档次了，各方面应该是平行的。不会光圈做大了，色彩纠正很查。
另外一个因素是显示器。一般家用的显示器，色彩不精确的话，有可能相片的区别背显
示器给淹没了。
IMHO. |
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p*****n
发帖数: 981 | 35 ☆─────────────────────────────────────☆
else (where) 于 (Mon Jan 22 14:29:08 2007) 提到:
Overexpressed one protein in human cell line and found the granular staining
pattern, seems like intracelluar transport vesicles. Can anybody give some
hints about the cellular compartments? See attached pics (green is
overexpressed protein, blue is nucleus).
Thanks
☆─────────────────────────────────────☆
Biomacro (革命好青年) 于 (Mon Jan 22 14:38:25 2007) 提到:
像intrcellular vesicles.
不过有个疑问，你是用DAPI染的核吧？为啥核周 |
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c****k
发帖数: 13 | 36 直接往细胞里加就行了（主要是看初始浓度是多少，然后才好觉得稀释倍数，一般买7-
AAD的时候都有说明），室温5min 就可以做flow了
不过gate死细胞，用dapi更好，不用做compensation |
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h******y
发帖数: 1374 | 37 为啥DAPI不需要compensation啊？
会不会和另外两个dye，FITC，CellVue(excitation= 655nm,emission=675nm)冲突啊
7- |
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c*********r
发帖数: 1312 | 38 谢谢，海胆16细胞时候in situ hybridization的图。DAPI染核，红色的是in situ的信
号，merge。但是这个是sense strand probe，应该是用来做control的，结果却有信号
，老板不信，结果没用。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 Almost the same for staining nucleus.
But for staining small DNAs such as the the mitochondria plasmid, Hoechst is
better. |
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b*****l
发帖数: 9499 | 41 r u sure?
in my lab, blue is labeled as DAPI, green FITC, and red RHOD.
blue"
，这 |
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b*****l
发帖数: 9499 | 42 这个我当然知道。我是说，大家通常 label channel 时是按啥规范？
我从未见过按 excitation 来 label channel 的。。。俺的显微镜自带的 label 最短
也就是 DAPI 了。要是按 Sunnyday 的意思，岂不是还要附带一个 label 上面写明 UV？
查了一下几家公司，有显微镜公司，有卖 antibody 的公司，还有说明书，都是按
emission 来 label 的。
大家的实验室都是怎么 label 的？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 In my understanding, the most professional way is to label it with the
exitation wavelength, simply because the excitation is strictly controlled
by the sysytem, but the emission is not. The emission wavelength is mainly
controled by the chromophore whichever you use.
However, for the convenience of most user, the labeling of the channel are
often changed to its target chromophores, for example, DAPI, FITC,and TRITC,
which is also appropriate.
But it is not exactly appropriate to label it as "em |
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d*********y
发帖数: 473 | 44 633挺好用的，还可以加上DAPI搞4种颜色。 |
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o**i
发帖数: 1165 | 45 难道google不到imager J的说明么？
staining
see |
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L****S
发帖数: 76 | 46 Thank bigsail (河马·轩辕三光) very much. I will try your method. |
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p******6
发帖数: 410 | 47 跟贴同问一下，那些是比较公认的标准senescence marker,似乎SA-B-Gal是个金标准，
不用它的话p16, p21, HP1 gamma以及DAPI染出的heterochromatin foci能取代吗？ |
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