k****o
发帖数: 589 | 1 请问chromatography没机会操作，光看书有意义吗？找工作的时候说原理懂是不是没用
？我这辈子就反相HPLC C18跑过三个月。 |
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d********e
发帖数: 81 | 2 platinum EPS C18 analytical column with dimensions of 250mm × 4.6mm and a
particle size of 5 um,
UV-Vis detector at 254 nm.
EDTA is the additive of the blood collection tube and 7.2mg inside the 4ml
tube.
Thank you... |
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p*********n
发帖数: 556 | 3 用C18 ion pair, rentention time很不一样的说。 |
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K******S
发帖数: 10109 | 4 It depends on your protein's amino acid sequence and what kind of enzyme you
use. For example, trypsin cleaves c-terminus of K and R (not if the
following amino acid is P) so you could get peptides with various length.
Each mass spectrometer has its own mass range that will determine how big/
small it can detect. And if you use LC-MS/MS instrument, the analytical
column also contributes to the detection. C18 columns can't retain
hydrophilic peptides very well. |
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s****n
发帖数: 234 | 5 This is how we make home-made Halo-Atto647N in our lab using amine/NHS ester
chemistry. It is probably not the most cost-efficient way, but we did get
huge amount of Halo-Atto647N. Hope this would help.
Reagents and Reaction Set Up:
Dissolve 5mg of Atto NHS ester in 400ul of Anhydrous N,N DMF. (Final
Concentration 10mM)
Add 120 ul of 100mM stock solution of Amino HaloTag Ligand. (Final
Concentration 20mM)
Add 3.1 ul of DIPEA (reagent grade) to the solution. (Final Concentration
30mM)
Bring final... 阅读全帖 |
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m*1
发帖数: 41 | 6 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: mm1 (mm1), 信区: Chemistry
标 题: 求指导!RP-HPLC分离monoclonal antibody
关键字: 分离 HPLC antibody
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 2 15:13:19 2012, 美东)
rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
到...
有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。 |
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g*****x
发帖数: 3283 | 7 1. “只有一个峰”是“很纯”的必要不充分条件。举个最简单的例子，两种手性化合
物在普通C18柱子上无法分离仍然是单峰，但确确实实是两种isomer的混合物。
2. 有时候会有一些含量非常低的杂质，但吸光系数非常高，这个很正常，不能只通过
这个判断纯度。
3. 如果你怀疑纯度有问题，最可靠的办法是NMR。 |
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p***7
发帖数: 535 | 8 Here is the mobile phase
0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6
1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6
10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6
17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6
22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6
C18 reverse phase column Flurescence detector
Thanks so much |
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F******k
发帖数: 55 | 10 我知道C18的柱子有板可以跑的，类比效果就不清楚了 |
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K********A
发帖数: 917 | 11 RPHPLC，用的C18柱子，想分盐和PEPTIDE，H2O/ACN 是solvent，有没有什么 modifier
能让retention time 缩短 |
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l*****u
发帖数: 1788 | 12 是啊，为啥非要C18柱子呢?
非要用的话，MeOH也比ACN好些？ |
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U*****e
发帖数: 40 | 13 C18 SFE is sufficient, HPLC is not necessary. |
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p**********m
发帖数: 472 | 14 这不就是desalt的吗， 我觉的用C18 cartridge 足够了 |
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M****d
发帖数: 131 | 15 需要分的是分子量2000左右的有机物，极性不是特别大，大致极性是在silica和C18上
都要拖。准备自己填一根大玻璃柱，看了一下resin，只查到两家：
BIO-RAD的polystyrene beads和Tosoh的toyopearl的hydroxylated methacrylic beads
前者理论上来说是完全hydrophobic的，后者表面有OH，理论上会有吸附？
就我的用途来说是不是应该用polystyrene的比较好？
还有什么推荐的vender吗？BIO-RAD beads的operating range跟我的体系不是特别地
match
谢谢！ |
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p*******8
发帖数: 158 | 16 RP HPLC C18 methanol-water take a try. If peak is not good, try organic
modifier. I have done some aromatic diamines in gradient. |
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p**********m
发帖数: 472 | 17 我的条件.
column 250mm*21mm C18.
mobile phase methanol and 0,1% formic acid.
injection volumn: 2ml.
injection mass: 100mg
elution condition: 5%-90% 30min and hold 90% 8min |
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s**c
发帖数: 34339 | 18 DNA最好是纯化后除过盐的，否则噪音太大，很难看到离子峰。
除盐的方法可以有很多种，用G25柱子除，或者用小的C18 Cartrige除都可以。
另外，在做质谱的时候，注意你选的方法中的离子范围，激光强度等。
DNA的量一般要在0.01OD，大概是100pmol左右。
Matrix好像我们用的都一样 |
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y********r
发帖数: 241 | 19 我想测泥水土混合物（以水为主，固体含量~3%）中的氯苯类物质的含量（单氯苯到四
氯苯），因为样品量比较少（1ml），而且估计氯苯大都在泥土里，水相浓度应该很低
，所以初步的想法是用hexane萃取然后用HPLC-UV检测。但是不太确定用什么流动相可
以和hexane互溶（固定相是C18柱）。而且我的样品可能浓度不大，所以想进样量大一
点（100ul）以保证能检测到。看到有人论文里是用60:40的乙腈：水，但是我试了一下
，至少1ml的这种流动相跟100ul的hexane是不互溶的，所以想来请教一下,用这种流动
相会不会有问题，比如hexane被堵在柱子里不容易流出？有没有别的更好的流动相选择？
另外一个可能的方法是用GC-ECD来测，这样的话hexane提取液进样倒没什么问题，但是
ECD对单氯苯的检测限太高了，测不出来。用FID会不会好一点？但是用FID的话，有机
溶剂的峰又会太大，好像也是
个大问题。不知道有没有人熟悉仪器分析的可以指点一下？多谢：） |
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K****l
发帖数: 861 | 20 先谢谢...
最近用HPLC分离24个碱基对，分子量6600的DNA
用的是waters的XBridge OST C18 Columns
但是每次一进样，大概30-40秒就出现一个类似产物的峰就出来了（260nm，Abs）
之后几十分钟都没峰出现了
我用的体系是A：methanol B：TEA-HFIP in water
后来试了TEA-HFIP&ACN的体系也是一样，一上样就下来
不知道这种现象是为什么？如果是柱子坏了的话，如何判断确定是否真的坏了？
谢谢 |
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m**n
发帖数: 206 | 21 What is the pore size of the column? 300A? much smaller than filter pores |
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m**n
发帖数: 206 | 22 also 5 um particles give intra particle pore size around 0.75 um, not much
larger than filter pores, could get clogged. |
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y**********t
发帖数: 37 | 23 From my personal experience, as long as samples get filtered by .22 um, it
should be fine. My sample substrates are even worse than yours.
) |
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c****r
发帖数: 126 | 25 我做HPLC的时候，最近出现一个问题，基线出现大的漂移。流动相为(A)0.1% TFA/
water, (B)0.1% TFA/acetonitrile, C18 column, 如果是isocratic没有什么问题，但
是走梯度的时候，比如%B从10到30， 基线就出现大的漂移，呈现为一条和水平相交30
度甚至更大的直线。我换了柱子，重新配流动相，把B的TFA去掉，用IPA洗流通池都没
有解决问题，还有什么可能？ |
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x*****9
发帖数: 68 | 26 好像一般测序啥的都用positive mode
因为我的peptides上有磷酸根， 所以想试一下negative ion mode，
mobile phase
A: 100% H2O 0.1% NH4OH,
B: 5% H2O 95 ACN 0.1% NH4OH
自己pack的 C18 capillary column
在一开始就碰到问题，
发现capillary column很容易堵住， 压力狂升， 最后系统shut down
有时候还能在tip上发现一些白色的crystal， 不知道啥东西
希望版上有经验的同学 指点指点 |
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x*****9
发帖数: 68 | 27 it happens during the column equilibration (before sample injection)
I am worried that maybe the basic mobile phase (with 0.1% NH4OH) partly
dissolved C18 beads. |
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o****e
发帖数: 1011 | 28 什么C18？fully endcapped？不是的话，pH7就可以了。
用NH4Ac，不要用NH4OH。如果你不想你pack的柱子本身跟强碱反应的话。 |
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t**n
发帖数: 4365 | 29 C18 suspension 的密度得小点，流速也低点。。。 |
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b*****y
发帖数: 175 | 30 Thanks again for all your new inputs!
Additional information:
1. I used Vydac MS C18 capillary column.
2. The sequence coverage of my protein (from trypsin digested peptides MS
analysis) is consistent (80%) for both non-treated and treated samples. So
my confusion is since the protein identity is confirmed from peptide MS
analysis, why it does not show in protein MS analysis.
3. We do not have MALDI in the lab so it is hard to check using another MS
technique.
4. I found out the 28498 Da peak in... 阅读全帖 |
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v******0
发帖数: 265 | 31 我最近在使用HILIC Column，是bare silica的那种。因为在测试摸条件阶段，所以就
拿一些tryptic digested peptide做sample,但我分出的峰基本上都很难看，很宽，而
且拖尾严重，重复性也不好，有时同一个sample,两天后用同一个column,本来peak
shape还凑或的峰变得又不好了。
我用的是HILIC-MS,mobile phase也试过加ammonium formate, pH基本在3-4，gradient
也试了不少，sample浓度从100fmol injection到10pmol injection都试过，sample一
般都resuspend在90% ACN中 （先用水溶解，再稀释到90% ACN),可结果大多不理想。不
过同样的system, 换成C18 column就非常好。
我在网上看到的一些example似乎都还不错，但大多数用的是UV detector,也有mass
spec的，不过column基本都是Amide 80或者zic-HILIC之类的，好像是有modified,不是
bared silica.
目前手头... 阅读全帖 |
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v******0
发帖数: 265 | 32 Thanks a lot.
Currently, I am only having this bare silica HILIC column, and the reason I
am still doing that is because I need test whether they are working properly
. My purpose is not to find a way separating some peptides, since I already
got good one with C18 column.
I might get some Amide 80 one, but it will take a while. I have little
experience on HILIC, so based on your opinion, I won't have good results (I
mean nice peak) using bare silica, no matter how I optimize the condition,
right... 阅读全帖 |
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d***e
发帖数: 1215 | 33 assume你用RP-HPLC. 酸性的分子在中性和碱性条件下往往没有retention,上面提到的
那些additive对提高retention都没有太多帮助。可以加tributylamine之类的ion pair
reagent, 如果C18柱上不retain, 可以试一试带极性group的RP柱子,如果还是不行，
可以试HILIC column.
其实很多酸性不稳定的东西，在柱子上走十几分钟是没有问题的， 可以测一下不同PH
的stability. |
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h*****t
发帖数: 1226 | 34 氨盐可以帮助分离, 而且也可以帮助提高酸性peptide的recovery
C18
peak, |
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S*****n
发帖数: 6055 | 35 I am listing my answers to the differences b/w gasoline and diesel powered
vehicles. I hoped to get more input but unfortunately did not see much.
Anyway I will offer baozi to the first 3 IDs who tried to answer.
1. Composition: the molecular weight of gasoline (C5-C9) is lower than
diesel (C9-C18). So in gasoline we use octane number but in diesel we use
cetane number. They both contain alkanes, alkenes (refineries try to reduce
alkenes), cyclics and aromatics. Alkanes (including cycloalkanes) ... 阅读全帖 |
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r*******p
发帖数: 130 | 36 最近在用HPLC分离一个4个羧酸，一个三级氨的两亲性分子（分子量~1400)。上C18反向
柱，25分钟里乙腈从0升到2%，我的东西基本上不沾柱子，3，4分钟就出来了。出来一
个大尖峰略带一点点拖尾或者是杂质，基本没有分离效果。水相加氨水调pH到8.4，25
分钟里0~25%乙腈,6.5分钟出来一个矮宽峰，拖尾拖到10min，-_-! 我也看不出来杂质
在哪
我的东西溶解度挺差的，用TFA有可能会析出来。这么多羧酸该用什么添加剂呢？
我不需要定量，只要能分离开收集打核磁就行了。
请各路大神帮帮忙，急死我了！
小弟感激不尽！！！ |
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s********3
发帖数: 40 | 38 求救。。。
有大侠知道HPLC如何分离这四种物质，苯甲酸，对二苯酚，EDTA(乙二胺四乙酸),三羧
基乙二醇，
可以选择下面的条件；
Conditions
Column: C18 Silica ，C8 Silica， Cyano phase,SiOH, PS-DVB, SAX
Column Size: 4.6 x 15cm 2.1 x 10cm
Detector: ELSD Diode Array MS
Initial Gradient Condition:
Final Gradient Condition:
Sample dissolved into:
Injection volume: |
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G*******X
发帖数: 1028 | 39 根据四个物质的性质，先选detector
1. Detetor: ELSD就是个joke。直接pass。EDTA(乙二胺四乙酸),三羧
基乙二醇，没有Uv吸收峰，所以要用质谱. Infuse injection of the four compounds
respectively to choose proper m/z for monitoring.
2. 质谱可以handle的flow rate比 diaode array小，所以column size 2.1x10cm
3.四个化合物三个是酸，极性都很强，C18、和C8留不住他们，会在void的时间流出的。
SAX是离子交换柱，一般mobile phase要加较大浓度的盐溶液，不适合质谱检测。
PS-DVB看产品介绍是只是用来将polar化合物从nonpolar化合物中分离出来的，像是纯
化用的。column本身没有官能团，对polar化合物没有分离作用。
SiOH，是normal phase column。是个选择。不过正相柱对水分很敏感，repeatability
有时候不好，不建议用。
Cyano如果是HILIC phas... 阅读全帖 |
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p*******w
发帖数: 311 | 40 用C18加ion pairing agent 行吗？
NH4Ac buffer加一点点的tetrabutylammonium hydroxide,用一定量的CH3CN？ |
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K*********e
发帖数: 183 | 41 All 4 are very polar or called hydrophilic, C18 or C8 are not going to
retain them.
In organic chemistry separation, we can use SiOH (use as normal phase), to
separate them. But in analytical separation,
Using HILIC column. |
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m*1
发帖数: 41 | 42 rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
到...
有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。 |
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o****e
发帖数: 1011 | 43 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
（freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
peak |
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l**j
发帖数: 651 | 44 c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb |
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j*****d
发帖数: 60 | 45 别说的那么神，这里是化学版，这版上的人不懂分析的难找。分析方法的develomement
步骤是固定的，就那几下子，没做过的人照猫画虎也能很快拿下，如果有化学知识还能
很好理解。
工作机会多那是真的，但不代表那东西有学问。你给我做个全合成试试，估计全合成的
文章你也看不懂。老实说我也看不懂。不像分析方法，C18建一个方法，C8再来一个，
C1-Cn还能来n个， CN,NH2，等还能接着再来，HPLC完了还有UPLC，TLC,GC,SFC等等，
UV完了还有MS，MS/MS,及别的一大串检测方法。分析当然也有高水平的创新方法，不过
公司里不用。你一说公司我就知道那分析方法高深不了。 |
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a******5
发帖数: 1 | 46 各位版友好
我想请问有什么类型的HILIC column适合分离sulfamate类的化合物呢?
想分析Acesulfame potassium, saccharin, cyclamate
但已经试过用C18的column RPLC 调过gradient ,ion-pair都分不太开
想要试试看新型的HILIC COLUMN
但是stationary phase琳琅满目不知道哪个效果较好
有看到Luna Diol, ZIC-HILIC, TSK-Amide 80等等...
不知道版友们有什么推荐的HILIC COLUMN可供使用?
感激不尽 |
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K*********e
发帖数: 183 | 47 如果你的化合物极性比较大, 选极性中等或教大stationary phase的就应该work. C18
对你的化合物肯定不好用.
HILIC column 其实就是正相色谱. 你的化合物极性都很大, 也许你用unbonded silica
based就可以, 你可以打电话给manufacturer, 他们回给你推荐的. |
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b*******g
发帖数: 1309 | 48 sometimes people want to keep consistent, R2 mostly refers to C18, and R1 is
methyl.
In T3, there is no R1, only R2 exits. |
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l**y
发帖数: 595 | 49 想买一个prep column (C18) 250mm x 20 mm,manual上说建议10-20 ml/min,如果我用
br />
5ml/min来run,会work吗?担心pressure上不去 |
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