m*1
发帖数: 41 | 1 rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
到...
有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。 |
o****e
发帖数: 1011 | 2 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
（freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
peak
【在 m*1 的大作中提到】
: rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
: mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
: 尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
: 就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
: 到...
: 有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
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l**j
发帖数: 651 | 3 c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
【在 o****e 的大作中提到】
: 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
: 另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
: （freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
:
: peak
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s*******h
发帖数: 3731 | 4 女神出现了。。。。
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
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m*1
发帖数: 41 | 5 能不能保持性质都是后话了 好像是准备跟MS联用 需要先能够分出来再说....
【在 o****e 的大作中提到】
: 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
: 另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
: （freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
:
: peak
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m*1
发帖数: 41 | 6 谢谢！我分离的rhuMAb 是水溶性的 问题是Phenomenex自己用这个wideporeC18分离lgG
的效果很好... 我不知道是不是我的分离条件有问题....
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
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b*********2
发帖数: 190 | 7 上Varian的diphenyl，对mAb,ligh chain/heavy chain, fragments都效果比较好 |
k****o
发帖数: 728 | 8 看看Phenomenex Aeris widepore C18 column 公司自己提供的分离的例子是什么条件
？不过多半只会给HPLC-UV的图，那样的话多半会加添加剂比如PEG啥的得到resolution
很高的分离图。但你如果是MS分析的话就别想添加剂了。另外TFA严重降低MS
sensitivity。换FA会好很多，不过resolution不如TFA。
另外，你load IgG到C18上用的buffer条件是什么，这个也会有影响。还有load
多少量，要考虑column的loading capacity。
peak
【在 m*1 的大作中提到】
: rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
: mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
: 尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
: 就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
: 到...
: 有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
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x****o
发帖数: 60 | 9 Not sure your purpose of separation and RP-HPLC was chosen. If it's for
quantitation, other techniques may work, IEF, CIEF iCIEF
I assume SEC-HPLC can not separate these two mAbs |
d***e
发帖数: 1215 | 10 my suggestion:
CN or C4 column
column temperature >60C
Reduce mAb if possible
or
Collect peaks from HIC column
or
SEC, if just need desalt mAb for MS |
d***e
发帖数: 1215 | 11 general rule: bigger protein need short stationary phase chain to reduce
interaction and improve peak shape/recovery.The problem here is too much
absorbance on stationary phase
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
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x****o
发帖数: 60 | 12 Adsorption on the stationary phase might be a very good reason. Used to work
with Non-porous silica reversed phase HPLC (Beckman ProteomeLab PF2D). This
reverse phase column gives very good peak shapes for proteins.And fractions
can be collected for downstream analysis |
