J********n
发帖数: 534 | 1 "因为用了Endo H和PNGase F两个糖基化酶分子量只减少了几个kD"
Endo H对糖的种类和修饰敏感，PNGase跟蛋白结构有关。
要看用什么系统表达的，几个N糖基化位点。如果4个位点以上，很轻易就上10kD。 |
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P*********e
发帖数: 112 | 2 RT
就是真空抽滤，具体参数查不到，不考虑具体压力等因素，求问个大概滤纸膜孔半径大小
要让10kD以上的Melonoidins分子在滤纸上，
膜孔半径用0.45um（微米，暂时用不了小键盘希腊字）或0.22um的能截住吗？
现在手上只有这两种膜，这两种膜一般能截住多少kD的？
非常感谢！！！ |
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P*********e
发帖数: 112 | 3 就是真空抽滤，具体参数查不到，不考虑具体压力等因素，求问个大概滤纸膜孔半径大小
要让10kD的Melonoidins分子在滤纸上，
膜孔半径用0.45um（微米，暂时用不了小键盘希腊字）或0.22um的能截住吗？
现在手上只有这两种膜，这两种膜一般能截住多少kD的？
非常感谢！！！ |
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h*********y
发帖数: 79 | 4 感谢楼上几位兄弟支招，现总结并讨论如下
(1). biotin技术(基于Crosslinking的Lable transfer方法)
感觉应该是应用于细胞内。本人使用的是体外重组蛋白
(2). microscale thermophoresis
没做过MST，仅知道MST能计算Kd，是否也能定量计算分子量或者结合比？有没有做过的
牛人帮我介绍一下？
(3). NMR
蛋白分子量太大。。。
(4). Size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light scattering (SEC
-MALS)
从本人实验来看，蛋白A为10KD，配体B蛋白120KD，该方法测定的分子量精度不足以区
分120KD上添加了几个10KD。
(5). 不同的荧光技术（FRET, BRET, Quenching, PF）
如(4)，不知道如何定量。
(6).ETH有个人专门做蛋白组的，可以分离protein complexes，这个或许相关
分离不成问题，关键是定分子量。。。
除了以上建议，另外有朋友建议用Beckman 分析定量超速离心机 Beckma... 阅读全帖 |
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t********1
发帖数: 87 | 5 求助版上的各位大侠：
事情是这样的：我国内的一个朋友需要向美国的一家公司付款。因为种种原因他不
能直接向那家公司支付，想通过我的账户中转。即他把钱从国内汇到我的账户，然后由
我付给那个公司，数额大概是10KD。我担心我这边收款可能要缴纳个人所得税。不知各
位版上的大侠是否有类似经验。这个会被银行要求缴税么？如果要缴税的话，那么税率
是多少呢？ 谢谢 |
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s*******7
发帖数: 160 | 6 如题，已排除N-糖基化，因为用了Endo H和PNGase F两个糖基化酶分子量只减少了几个
kD。不知磷酸化一般可增加多少，还有其他什么修饰可增加多一些呢？
谢谢！ |
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h**********8
发帖数: 650 | 10 Sumo is around 26kD, I guess it is Ubiquitin. |
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F******y
发帖数: 1988 | 11 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
最好，没有的话讲讲实验tips也好。
包子奉上，小生在此有礼了。 |
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z****i
发帖数: 35 | 12 Caspase-1前体分子量是45kD，剪切后变成20kD的和10kD的蛋白，买的两种抗体能够同
时检测前体和p20，做了很多次都是45kD的位置很多条非特异条带，都分辨不出来目的
条带了，不过条带倒是很浓。20kD的则很淡，基本看不见，把曝光时间增加到很长也还
是很淡，若隐若现的。保证加的刺激能活化Caspase-1。
大家谁这个分子比较有经验，能否指点一下怎么才能跑出来20kD的那条带啊？......用
的是sigma和abcam的抗体。
也试过专门跑小分量的蛋白胶，45kD的带还行，20kD的那条带都不怎么成型了，斑斑点
点的，是不是转膜没转好呢？
谢谢啦！ |
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m********r
发帖数: 124 | 13 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
不知道谁的对；
我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
蛋白的N端，有可能吗？ |
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s*****r
发帖数: 223 | 14 我搭车问一个，磷酸化的功能。
我做的一个蛋白，正常情况下在核内（RNA/DNA binding protein)，我诱导细胞凋亡后
，它跑到细胞质，并且磷酸化(ser/thr)(大概10KD左右）。现在知道这个蛋白突变会引
起凋亡。
我现在在设计实验，想知道这个磷酸化的功能意义。
我是新手(应该多读点文献），
不知道磷酸化，1。跟蛋白的降解是否有关系？
2。磷酸化RNA/DNA binding protein 的功能关系？
3。其它还有啥可能
谢谢 |
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s********r
发帖数: 312 | 15 我用的BD的Y705，非常好，就一条带。你这个大小差别有10kd了吧，不像是stat3 beta |
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e****e
发帖数: 1042 | 16 就大小不一样呗！我要的产物是3kD左右的peptide，其它的都是杂质，我想知道比如大
于10kD的protein的量是多少，就算是protein的杂质量。我不需要分离它们。 |
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b*********0
发帖数: 4 | 17 1. 那个70多kD 是根据amino acid sequence推算出来的理论值，不是真正在gel
migration上的位置。
2. 同样的蛋白用同样的ladder在不同的gel(invitrogen bis-tris, Bio-rad Tris-
glycine 系统上跑出来的都可能差10kD左右。）
3. MS给出的结果一般是比较靠谱的，尤其是SC（spectrum counts, e.g., sequenced
times）
4. 如果能弄到相关抗体的话， 可以做个western就可以确认了。 |
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n********e
发帖数: 1630 | 18 不会。manual上说的是>10kd, 我说了，15v的时候不会over flow |
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s**********a
发帖数: 92 | 19 一个蛋白，分成几个片段，MYC tag，转染进２９３T，其他片段都能用anti－MYC
antibody 检测到，只有分子量最小的那个 (70 个氨基酸,加上Tag啥的，总共不超过
10KD。)，检测不到。但把这个片段克隆进原核表达
载体能在细菌中表达。
请问这是一种什么情况，大家遇到过么，怎么解决，谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 我们本来是想做一个可诱导表达的蛋白载体，在同事们中问了一圈，只有一个人有一个
tetracyclin-inducible vector for shRNA (Tet-On pLKO) ,而且promoter 是H1。 我
想问的是，假如
我用这个来表达一个很小的蛋白（10kd)行不行？ |
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m********e
发帖数: 349 | 21 对阿，不能过一个size exclusion的柱子么， 把小于10kd的都留在柱子里。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 22 Rosetta做单纯的de nove structure prediction结果可能没有想象中的那么好。当然
，对于<10kD的蛋白而言确实可以接近同源建模的水平，但对于大蛋白而言，大致还停
留在“理论”阶段，除非特殊情况，RMSD>10A可以算常态吧。此外，除了Baker本家之
外，其他外人能玩得转Rosseta的似乎屈指可数:)目前个人觉得Rosetta所适用的，除了
小蛋白结构预测/设计之外，应该算是structure refinement这块，部分结合实验结果
，能获得非常好的效果。
对于存在显著的已知同源结构的蛋白而言，我个人相信基于homology modelling的预测
方法仍然会是首选，可靠性很有保障。Homology modelling进一步结合Rosetta自然是
很好的思路，但前提是你能玩得转它，呵呵。 |
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b*******g
发帖数: 1309 | 23 用 molecular weight cut off membrane，有3K，5K,10K etc 可供选择
fisher有的卖，millipore的 |
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b******l
发帖数: 48 | 24 找找这两个膜的MWCO吧，如果有的话，基本上就能比较了。膜孔径大小是个平均值，MW
CO更具比较性吧
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h***e
发帖数: 20195 | 25 没有任何可能拦住
这样举例吧，配细胞培养液用的滤膜孔径就是0.45左右的，FBS蛋白分子都完全穿过的
，1百多万的透明质酸溶液直径也就几百纳米
你这个只能买COMW 1,000的渗析膜，那种4，000或者6,-8,000的损失会非常大
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z**l
发帖数: 1192 | 26 What is up, 10kd? How is your Daiwa sol doing? |
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