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Z******5
发帖数: 435 | 3 NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents
Thermo （Pierce）的，货号78833或78835 |
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w*****n
发帖数: 107 | 5 PARIS from ambion is also good |
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b***a
发帖数: 147 | 6 从一个细胞株里提的蛋白，IgG做阴性对照，分别测蛋白A和蛋白B，用蛋白C做阳性对照。
结果是，input的lane里面都是干干净净，一点都没有，IgG的lane，可以见到重链，但
是向下的拖影很严重，蛋白A/B/C也是这样，拖影很严重，目的条带似有似无，第一次
做这几个蛋白，据说蛋白C是阳性对照，应该不错 的。
对了，A和B是核蛋白，我提的是总蛋白，就是提取的时候，用裂解液时间长一些，
vortex剧烈些。
觉得奇怪的是，为什么input里面干干净净，IP以后 反而有东西？这不是无中生有么？
我觉得从结果看，Western blot的过程应该没问题的，感觉是IP的问题，拖影可能是洗
脱的不够吧，可是这无中生有就没法解释了，要是一个抗体还可能是什么步骤错了，可
是三个抗体都这样，就奇怪了。。
盼高手指点一二。。。。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 7 首先，这个蛋白的功能分类是什么 ？ 如果是transcription factor那么进核很正常
主要还是看之前对这个蛋白质的功能分类和报道才知道是不是big deal。
其次，我觉得IF可以放在第一步做，分核质的protocol经常有假阳性假阴性分不干净，反而不如显微镜下看结果可靠。
还有楼主internal control用的是什么？一般用tublin作cyto的control，这个比较可靠。
不过核蛋白control大都不可靠，即使有leakage往往也看不出来 |
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M*******C
发帖数: 183 | 8 我看了一下网站，兼容的试剂名单里没有SDS，你用它来做SDS的样品好用吗？
你说的蛋白沉淀下来再测是什么意思？就是裂解-离心-取上清？
比如我的细胞，我加了含SDS的去裂解，为了核蛋白，这样lysate很粘，我就去超声，
等离心后经常看不见沉淀，直接就拿去用了。
The RC DC protein assay is compatible with the following reagents and
buffers in addition to those compatible with the DC protein assay:
CHAPS 2% ReadyPrep sequential extraction reagents 2 and 3
DTT, 350 mM Sodium hydroxide, 2.5 M
EDTA, 0.1 M TBP, 2 mM
Imidazole, 0.5 M Tris, pH 8.4, 0.5 M
Laemmli buffer with 5% β-mercaptoethanol ... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 continue to LS from xml txt possible size limitation:
X射线衍射法测定DNA的晶体结构 was reported by Cambridge 物理学PD 克里克
>1953年，在威尔金斯和弗兰克林拍摄到的
DNA衍射照片的基础上，沃森和克里克提出了DNA双螺旋模型，给生物学带来一场
革命。
So why not NGKOT might be reported by another Oxford 物理学PD
detail:
克里克1937年从伦敦的大学学院物理系本科毕业后，又开始攻读物理博士学位，
但是1939年战争爆发，他被迫中断学业，为英国海军部工作，研制磁性水雷和感
音水雷。威尔金斯比克里克晚一年获得物理学士学位（剑桥大学），但在1940年
读完了物理学博士（伯明翰大学），其论文与雷达有关，在战争期间他参与研
制雷达，1943年又到美国伯克利参与曼哈顿计划研制原子弹。战争结束后，这些
曾经为战争的胜利立下汗马功劳的物理学家的出路成了问题。许多人必须改行。
其中不少年轻的物理学家，在大物理学家波尔和薛定锷的激励下，投身到生物学
... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 楼主
有薛定锷同样见识的跨生物和物理领域的人近70年以来就出了一个克里克吧
薛定锷在1944年出版的《生命是什么？》一书
full text link:
//whatislife.stanford.edu/LoCo_files/What-is-Life.pdf
cited from X-Y-S O-R-G
X射线衍射法测定DNA的晶体结构 was reported by Cambridge 物理学PD 克里克
>1953年，在威尔金斯和弗兰克林拍摄到的
DNA衍射照片的基础上，沃森和克里克提出了DNA双螺旋模型，给生物学带来一场
革命。
detail:
克里克1937年从伦敦的大学学院物理系本科毕业后，又开始攻读物理博士学位，
但是1939年战争爆发，他被迫中断学业，为英国海军部工作，研制磁性水雷和感
音水雷。威尔金斯比克里克晚一年获得物理学士学位（剑桥大学），但在1940年
读完了物理学博士（伯明翰大学），其论文与雷达有关，在战争期间他参与研
制雷达，1943年又到美国伯克利参与曼哈顿计划研制原子弹。战争结束后，这些
曾经为战争的胜利立下汗马功劳的物理学家的出路成了问题。许多人必须改... 阅读全帖 |
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w******n
发帖数: 767 | 11 是核蛋白么？
手里有一个project也是这样的，wb一抗提高到1：50检到两个蛋白，还有一个没搞定，
郁闷中。。。 |
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C*******h
发帖数: 75 | 13 大约一年半载前，跟我一起奋斗的小兄弟纯属偶然从我们自己建立的EMS突变体库中筛
选出一个有细胞死亡现象的突变体。接下来，我们主要做了以下两个方面的工作：
确立表现型与基因之间的因果关系
(A) 锁定细胞死亡，用传统的位置克隆法克隆到了基因。
(B) 用遗传互补的方式也确证了突变中的点突和包括细胞死亡在内的多种表型之间的
直接因果关系。
其二是涉及蛋白层次
(A) 全多肽链丙氨酸替代扫描，通过转基因手段在突变体 (系KNOCKOUT) 背景上转入
自身启动子驱动的携带某个位点丙氨酸替代的突变基因，考察替代位点和表型之间的关
系。工作量庞大，但所得并不多，虽找到了几个残基位点突变导致蛋白完全没有活性的
突变位点。总的来说，性价比不是太高，人力物力财力消耗都相当的大。但也算是有得
有失吧，比竟这个蛋白目前没有任何人有任何已知的认识。
(B) 用GUS标定，确定了组织和器官水平上该蛋白在活体内的表达模式。
(C) 用GFP标定，完成了该蛋白的亚细胞定位工作；而且也确定了该蛋白中存在一个非
常规或者说不同任何已知核定位信号的核定位信号。
(D) 也用删除多肽链前后的办法搞清楚了真正和... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 14 可以很负责的说在植物里面，还是核蛋白，只有一个tag那真的是太不容易了。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 15 首先恭喜你取得了进展。
你们基因对应表型的工作如果很solid的话，应该可以考虑上plant cell。
因为这个蛋白是个未知功能蛋白，从保守domain和功能domain下手是比较传统的考虑。
但是现在看起来应该是很费时费力，并且很可能很难得到最终的确定结果。我觉得不如
跳过这一步，而直接从其他角度开研究这个蛋白的功能。
如你说的，这个是一个核蛋白（GFP有时候并不完全可靠，free GFP也能定位到核内）
，可以考虑转录因子或者参与Chromatin remodeling等。如果你想搞到这个蛋白的
interator，当然很好。但是会费时费力，尤其是植物里，很多实验很难做。我不建议
朝这个方向。而且很多时候这个很可能跟一堆蛋白有interaction，结果转了一圈又回
到原地。
你还不如做个这个gene的inducible表达系统去看microarray。尤其是当你们已经知道
这个基因的功能跟凋亡和胁迫有关，很可能可以找到一些下游的重要基因。如果运气好
，找到一些重要的下游基因，后面的工作就够你5-10年做的了。
关于杂志.CNS恐怕会有难度，但是plant cell应该很有机会。... 阅读全帖 |
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s*********t
发帖数: 600 | 16 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
是浑浊的东西。
对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
，作为nuclear extract。
不知道液氮速冻这一步对于防止蛋白变性有好处，还是别的原因？为何需要速冻？
如果用于蛋白复合物的纯化，我以前是用300mM的盐。但是boss让我改成250mM... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 17 (2)
Deng XW早年真是golden boy。PhD薄厚期间都充斥CNS。
简历：
1978年-1982年： 获北京大学生物学学士学位
1982年-1985年： 获北京大学生物学硕士学位
1985年-1989年： 获美国加利福尼亚大学伯克利分校博士学位
1989年-1991年： 博士后课题－在美国耶鲁大学分子细胞发育生物学系研究拟南芥光形态建成的分子遗传学分析以及燕麦光敏色素A（phy A）基因的核蛋白与启动子相互作用的活体DNase指纹分析
1992年-1995年： 任美国耶鲁大学生物学系副教授
1995年-1999年： 任美国耶鲁大学分子细胞发育生物学系副教授
1999年-2001年： 任美国耶鲁大学分子细胞发育生物学系终身副教授
2000年- 今 ： 任北京大学-耶鲁大学植物分子遗传学及农业技术联合研究中心主任及北京大学长江特聘教授
2001年- 今 ： 任美国耶鲁大学分子细胞发育生物学系终身正教授
Deng开始PhD的时候他当时的老板Wilhelm Gruissem刚开始AP，而deng XW博士开始两年后的87年第一次发文就是cell，同年再一篇一作JCB。而且随后两年... 阅读全帖 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 19 artifact
这些事情很tricky的
我以前还发现一个 核蛋白和dicer相互作用
搜了半天，发现有篇文献还真这么描述，不过，一篇文献，显然太单薄了
最后不了了之
做mass spec，发现这些 new interactions， 实在是太多，
难的是如何编个故事making story |
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w********r
发帖数: 1431 | 20 新手拿针抽的时候控制不好容易吧核蛋白也搞出来。。。 |
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c*******0
发帖数: 190 | 21 最近在研究一个核蛋白的功能，需要用到GFP-tag的质粒转染...实验室只有含小鼠序列
的质粒，试过转染到Hela和MCF7细胞表达都比较好...而且这个蛋白在小鼠和人的同源
性在95%左右...求问用这个质粒做出来的结果投稿会被拒么？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 这个你确定么？
我以前用简单的Qiagen RNA extraction kit 的时候是不能排除掉plasmid的，
因为plasmid上没有核蛋白结合着，所以不会和蛋白一起变性沉下来。
不过因为我从来不用Trizol （窘了个窘），所以对此没有经验。 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 23 是需要的， 我老板要求做核蛋白的ip需要用DNAse处理。
不然可能会出现假阳性，两个蛋白都bind在一个nucleosome上，其实并没有
interaction |
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K*C
发帖数: 2825 | 24 做了个蛋白的mutant，换了200个bp左右，结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20
倍。然后做了一下
qPCR，发现是RNA的问题，RNA量下降了64倍。
然后我把这个mutant的200bp分成了3段，每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果
蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type，把上面3段中其中一段突变
到mutant的序列，结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变
成mutant的序列。
我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的
东西会影响transcription。谢谢！
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
taacggcagcccactgtattaatcagaccaagagcgtttcagttattgtaggggaaatagacatatcaagaaaaga
aaccagacgtcttctttctgtggataaaatatat... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 25 是不是也可能是degradation不一样。有啥药可以抑制一下的，处理看看？
20
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc |
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K*C
发帖数: 2825 | 26 你是说protein degradation？应当不至于，当然还有一种解释是mutant的蛋白有毒性
，比如因为misfold或是什么原因。feedback regulation降低mRNA的量。
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc |
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s******s
发帖数: 13035 | 27 RNA degradation
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc |
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K*C
发帖数: 2825 | 28 那主要应当是polyA问题吧，wt和mutant的poly A 应当没什么区别吧
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc |
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u******r
发帖数: 1541 | 29 你的序列GC含量有点高，可能会形成特殊二级结构影响转录
既然是mutant的序列，你可以自己改code换密码子
维持氨基酸序列不变的情况下，把GC/AT含量改的稳定一些，不要有些地方GC含量极高 |
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d****i
发帖数: 2346 | 30 最近在做p65的核内乙酰化，total的p65做得很好，但是乙酰化检测不到。抗体用的是
CST的。看到有的公司的western图片注解上说竟然用了180ug蛋白。。。。。。顺便请
大家推荐乙酰化p65抗体。谢谢！ |
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J********3
发帖数: 3151 | 32 非组蛋白乙酰化一般不大好检测， 最好先IP下来，再做WB。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 34 That's because the ac-p52 antibody is horrible. Same thing for Ac-Hsp90 etc
. It is the best to I.P. the protein and do acetyl-lysine antibody...the
problem is that acetyl-lysine ab is horrible, too. |
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d****i
发帖数: 2346 | 35
etc
谢谢！是提取nuclear protein做乙酰化western好 还是 从total cell lysate 里IP
以后做乙酰化好？我需要比较各个时间点乙酰化程度的不同。。。。 |
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K******S
发帖数: 10109 | 36 do mass spec if you don't have good antibodies. |
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A******y
发帖数: 2041 | 37 Total lysate. If you want to do mass spec., find a good lab to teach you.
Too many horrible mass spec core facility or labs these days.
IP |
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d****i
发帖数: 2346 | 38
非常感谢！ac-p65我试了abcam的抗体，能看见信号，就是很弱很弱。有个问题就是，
如果用total lysate就没法证明乙酰化的蛋白是核内起作用的。有人说乙酰化也可能发
生在胞浆。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 40
用nuclear lysate会不会更好？乙酰化应该是发生在核内。 |
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y***y
发帖数: 709 | 41 构建一个目标蛋白的GFP融合表达载体
转细胞，只有细胞核区域有荧光说明是核蛋白 |
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K****e
发帖数: 32 | 42 请教各位：
最近在Ecoli中表达真核细胞蛋白后跑胶用质谱检测，以外发现多种翻译后修饰，包括
甲基化、乙酰化和泛素化，从图谱上分析这些位点的鉴定可信度都还不错。按照以往的
知识Ecoli缺乏对真核蛋白翻译后修饰系统，不知大家之前是否观察到过同样现象或看
到过类似报道？谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 这两个蛋白能够纯化出来么？如果能的话，把它们和DNA 放到一起看看他们是否能够形
成复合体（这个有很多种方法可以检验，比方说把DNA连接在agarose 上)
如果单独是DNA 不行的话，那么就看看是不是需要核蛋白，你可以把纯化出来的核小体
进去。
当然，最重要的是，既然你们有KO cell,那么你们应该试图看看这些蛋白是干什么功能
的。 |
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y***i
发帖数: 11639 | 44 去他的微博看了一下，好像是他们公司自己发展出来的技术
“我们用Extreme Genome Editing (EGE)系统通过基因敲进的方式，分别跟ACTB（细胞
骨架）和LMNB1（核蛋白）加上GFP标签。可以看到其效率比CRISPR/Cas9高很多倍。而
且，通过各种检测，发现90％以上是同源重组，随机插入很少。现在我们正在做多基因
敲进，这对于研究细胞内蛋白相互作用非常有帮助。”
“这是在两个不同基因上分别敲进了DsRed和DTR-EGFP，并做成融合蛋白。这次敲进不
是用ODN, 而是比较大的DNA片段敲进。看来我们的EGE系统真的非常好用。是不是应该
发一篇文章。” |
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s*********s
发帖数: 110 | 45 sina上有个comment
NIBS-王晓东实验室发现Necrosis的分子机制 此博文包含图片 (2014-04-12 14:
41:15)[编辑][删除]转载▼
NIBS-王晓东实验室发现Necrosis的分子机制
NIBS-王晓东实验室发现Necrosis的分子机制
在April 10发表的Molecular Cell杂志封面文章中，王晓东实验室描述了MLKL的磷酸化
是如何导致了细胞程序化坏死的分子机制。MLKL的磷酸化使其从单体状态向多聚体状态
的转化。多聚化的MLKL可以结合多种磷脂，从而由细胞质（弥散分布）转移到细胞膜和
细胞器膜上；并在这些膜结构中形成通透性孔道，从而破坏膜的完整性，引起细胞坏死
。这一点有点类似于细胞凋亡中的重要的蛋白Bax和Bak, 在细胞凋亡领域，Bax/Bak在
细胞凋亡过程在线粒体表面聚集，多聚之后形成孔道，从而释放细胞色素C(Cyto C),
诱导细胞凋亡小体，从而激活Caspase3,最后导致细胞凋亡。
这篇文章同时介绍了王晓东实验室还开发了(Epitomics公司)能特异识别人源p-MLKL磷
酸化的单克隆抗体，并证明这一磷酸... 阅读全帖 |
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R****n
发帖数: 708 | 47 Lu was in my department last year. probably I can try to shoot him an email.
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D***a
发帖数: 516 | 48 我对此也有问题。一般都是先低渗把细胞质和核分开，再用高盐来分离细胞核的蛋白和
DNA。那么在此高盐环境下，我想观察的蛋白蛋白相互作用是不是也被破坏了？
能不能拿到细胞核后，在正常buffer里用超声打断DNA（或用DNase），用这个产物来做
CoIP？ |
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