w*******d
发帖数: 396 | 1 一点建议。
1.买一个BAC作模板。
2.或者先PCR两个1K的片段，然后再做1次2K的PCR。
3.或者连续做两次PCR。把第一次的产物稀释1000倍，然后做第二次的底物。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 2 搭车问一下，在一个酶的active site，和底物相互作用的关键位点上，M->K这种变化
可能有哪些理化影响？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 3
这个问题很简单啊，因为那个酶的底物并不仅仅限于那个蛋白。
有可能其他需要被修饰的蛋白和A通路有关吧。但是A通路不是这个文章的重点，
所以我们几乎没有怎么提及它。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 4 多谢如上建议，听起来都是复杂的技术或工作量大。
决定做活性分析了，希望完全结合的复合体对底物更有选择性。
确认后纯化蛋白质结晶长晶体。 |
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c********b
发帖数: 363 | 5 比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。 |
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c********b
发帖数: 363 | 6 比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。 |
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g*****p
发帖数: 451 | 7 这个问题不难回答
从你以前的帖子已经知道你找到了酶被水解的位点
那你只需要合成一段相关的底物就可以了
然后还可以标记一下荧光，加点酶，看能不能切
要是能切的话，连kcat/km都可以算出来
如果能切，一般来说trans-leavage和cis-cleavage的认定才是
最头疼的事
一般来说得需要做个核磁或者晶体结构才行
要是你能拿到zymogen的结构呢，这个是比较好回答了
但你也说了这个酶不稳定，你想拿到zymogen的结构不做几个点突变把它稳定住
是不行的
不过现在为止你的实验数据有点让我困惑的地方（我不是说你的实验数据不对，只是说很
难解释这个现象，所以希望你先再确证一下）
1.你说4度放过夜，该酶都会变成truncated，这个和你开始express出来recombinant的
protease有两者混合的现象结合起来看，很难让我相信这个酶会有autocleavage的活性
因为要知道，ecoli表达重组蛋白，其细胞中的protease浓度是很高的。如果真的具有
自剪切活性，你根本不可能拿到full-length的protease,expression的时候就自己切光
了。因... 阅读全帖 |
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h**********r
发帖数: 671 | 8 以前没做过EP PCR，想通过这个方法改变一个蛋白质的底物偏好性。请问大家是用kit
呢还是自己配mix reaction呢？
看了一下clonetech的和Stratagene的kit,都至少要四五百刀。穷！大家还有啥好的推
荐没？
多谢！
定有包子酬谢！ |
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m*******3
发帖数: 25 | 9 我想检测一个激酶对底物的磷酸化，从大肠杆菌中纯化了蛋白，进行体外磷酸化反应，
然后用
sigma的丝氨酸特异的磷酸化抗体进行检测，结果发现预染的marker显出了非常深的带
，不知为什
么，谢谢大家！ |
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d*********e
发帖数: 18 | 11 通过gel shift assay (EMSA)计算了蛋白跟一系列底物的结合常数kd.
但是审稿人说：EMSA measurements are non-equilibrium and do not yield Kd
values.
请教应该如何回应？
有些文献用表观解离常数kapp来替代kd，这个是否正确？
谢谢。 |
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d*********e
发帖数: 18 | 12 谢谢回复。
我只是想比较同一蛋白对不同底物的结合能力。Kapp应该可以说明问题。
proteins
paper |
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g***j
发帖数: 40861 | 13 怎么以前可以做出来，现在出不来了
同样的program 同样的底物 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 just try
//www.molmovdb.org/cgi-bin/morph.cgi?ID=538723-32748
//molmovdb.mbb.yale.edu/molmovdb/
others just go to
//dirac.cnrs-orleans.fr/DomainFinder/links.html |
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h**********r
发帖数: 671 | 16 Thanks LS!
Please check the BAOZI. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 Re rien
three BAOZI got, Thank you.
BTW, plus one paper:
Predicting protein ligand binding motions with the Conformation Explorer
Flores, S.C. and Gerstein, M.B. (2011) BMC Bioinformatics, 12: 417 (Highly
Accessed).
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22032721
its corresponding author link:
//xray.bmc.uu.se/flores/Papers.html |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 Your said is right
but now might we can refer below methods reported by
Swedish team and Yale Team:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22032721
corresponding author:
//xray.bmc.uu.se/flores/Papers.html |
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h**********r
发帖数: 671 | 19 认真看了LS的回帖和paper,还是似懂非懂的。
是不是蛋白质结构比较弱的人不适合做这种project呢？
另外找个合作者是不是更靠谱呢？
多谢！
另外对autodock这个软件解决这类问题怎么样？
有点唐：（
多谢多谢！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 please refer below UK professor his CV:
//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/new/cv.html
so not PhD of relative Biophysics you never can hope to fix this field by yourself.
You/or your boss can contact to him if you had project for collaboration.
//www.lifesci.dundee.ac.uk/people/daan-van-aalten
For
> 另外对autodock这个软件解决这类问题怎么样？
//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg/
NB: it was built by above UK professor his team.
more other relative X-ray Structure biology analysis tools:
please go to
//xray.bmc.uu.se/hic... 阅读全帖 |
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K**4
发帖数: 1015 | 21 做点突变 ，测酶活性而已
不需要什么 计算
况且结构计算 已经没有人 相信了
连文章 都看不到了
往往蛋白质活性中心有 一组residues用于催化
同时还有 几个 residues用于 bind ligand.
所以你只要根据sequence／structure找到 这些 residues，做个突变就可以吧 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 22 严重同意，只要你筛选手段过关，敏感而且通量大，做起来远远超过模拟预测基础上的
设计速度。 |
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o****u
发帖数: 214 | 24 真心觉得这是偷懒的做法。
不是说你，是指目前的整个科研界。
说白了，搞预测需要研究者同时具有非常强大的物理基础，化学基础和编程能力。普通
生物背景的人玩不转这个的。能同时在这几个领域都是expert的全世界还是能找出几个
人来，但是他们一般不愿意搞这行，收入太低，都去赚其他钱去了。
目前真正能做预测的只有DAVID BAKER。有很多号称搞结构预测的组其实都是噱头而已
，大多是有了结果然后用计算机模拟去解释一下。或者即使预测了一大堆突变，只有一
个运气好的能起点作用，发文章了事。就算是david本人，他的出发点也颇有些问题。
他的算法还是基于反应的transition state的。而从catalytic antibody的整体失败来
看，酶催化的本质可能并不符合这个经典Model。所以他的几个所谓计算机设计的酶，
其实还是要N轮的定向进化后才能用。Hellinga其实也有实力去做这个，但是他的
science撤稿以后，他的科研生涯已经基本宣告结束，现在听说靠卖仪器维持实验室的运
转了。
不过现在计算机越来越快，以前在计算中必须要忽略的东西，现在也可以做了，这个领
域很快会有大突破的。... 阅读全帖 |
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h**********r
发帖数: 671 | 25 Thanks!
F. Arnold读了许多。
结构这块儿我是handle不了的～～
也认识几个早期在stemmer的maxygen工作过的人～ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 26 搞湿的In Vivo In vitro 水系的筛选的 目前尚不理解搞干的结晶 in vivo vitro X-
ray 数据解析筛选 也可能是一个新行当
361/N行吧? SHI YI Gong 行头within mainland China.
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 YOU SURE?
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19906726
Berkholz DS, Krenesky PB, Davidson JR, Karplus PA.
Protein Geometry Database: a flexible engine to explore backbone
conformations and their relationships to covalent geometry.
Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(Database issue):D320-5 |
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h**********r
发帖数: 671 | 28 谢谢大家的讨论。其实对不同领域的人不能太苛求，当然严谨一点是必要的。像
protein engineering这样的工具对于很对领域都十分有用，可是由于“术业有专攻”
，又没办法弄得很透彻。和人合作吧，别人也不想沦为工具，而且怎么都没有自己掌握
来得顺手～～就像自家有个Wii，想啥时候打就啥时候打，不用看别人的脸色，也有个
沟通的问题～～你的左手挠不到我右手的痒哈
很多都这样～～ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 29 Exactly
not different fields, even same Systems Biology: microscopy System Biologist
almost does not
care Theory Modeling System Biologist what he/she did and reported and it is
almost no problem for his/her
career development. |
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p*****u
发帖数: 191 | 30 很多不是做计算的，老以为就是把软件玩一玩就行了。这种态度是不对的，然后做不出
来就说计算不可信。计算这领域的水很深，我个人认为，如果做酶方面的计算，没有量
子化学基础根本做不深。很多灌水的文章企图用分子力学去解释机制，我觉得这就根本
说不清。纵然通过大量突变可以得出某个结果，可仍然是费时费力，这就相当于算法里
的random search然后找到一个解。可人毕竟不是计算机阿。
针对 protein engineering，还是要有考虑的：
1. 选择的突变是针对对catalytic反应，还是针对 substrate binding，还是对于中间
态的稳定？
2. 突变对蛋白的stability有影响没？这属于物理化学的范畴吧。。。
3. 水分子在活性中心是否有作用，突变会不会造成水分子的侵入，或者其他极性基团
的侵入。
等等
并不是说计算没人相信了，真正让我们做生物的去做计算，恐怕光数学知识就得补一堆
。单单一个分子三维显示，说明不了什么。有一个量的东西在里面。目前做的较好的就
是QM/MM了，可是在QM里方法又不一。我看单纯从实验去阐明催化机理很难吧，倒是一
堆的假设推理。 |
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K**4
发帖数: 1015 | 31 DAVID BAKER 是做 酶的全新设计的吧
至于结构预测，真给他几个序列，恐怕他还真handle不了 |
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h**********r
发帖数: 671 | 32 Thanks! I tried autodock from Scripps. Because I don't know 结构计算,量子化
学, 非常强大的物理基础，化学基础和编程能力, I cannot go deeply.
On the other hand, my designed screening method does work well. We are
writing a proposal and finding some collaborators from LANL, I'd like to
hear their opinion.
Thanks!
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g*****p
发帖数: 451 | 34 3-D结构预测严格的说
没人能做
真正能预测比较理想的也就是同源模建
DAVID BAKER弄得不错，主要是因为有想法，又能搞噱头
比如他发动大家打电子游戏弄model, 然后发篇nsb的文章
本身文章也就是biochemistry, jbc
不过他掺了游戏玩家打电子游戏的噱头，就对上nsb喜欢吸引观众眼球的一贯胃口了
另外从头设计新蛋白这块基本全是噱头
反正一堆民工天天做pcr，然后哪个测出点稀奇古怪的活性
就硬凹说是自己算法“算”出来的
这样一说估计要打击一大批人了，而且可能又打击一些人的积极性了
这不是说protein 从头design, 结构预测不好
东西是好的，只是现在的数理发展水平远远提供不了解决这么难问题的工具
再过个50、百把年再看吧 |
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a*******n
发帖数: 156 | 35
用计算的方法设计蛋白遇到的问题不是理论问题, 而是计算能力问题
这个短时间内根本不会有突破 |
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s**a
发帖数: 293 | 37 也许内源表达太低测不到……全细胞裂解液的 positive control 有没有条带？
没的话换用高灵敏度的发光底物试试
1ug |
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m******5
发帖数: 1383 | 38 不过我叫得LZ的问题没那么复杂吧？
能不能就做个蔗糖梯度然后取26S组分做荧光底物以及泡脚看pattern?
不用走柱子了吧 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub，
否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
所以这个de-ub 不是一个问题。
成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
autophagosome的底物，所以不是那么的特异。
如果这个问题对你们非常重要的话，我建议你用三种方法来重复：
1. uncleavable ub-GFP
2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
3. partially purified proteasome with artificial substrate
然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
autophagy |
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x***o
发帖数: 47 | 40 有个问题想请教大家一下。做的一个蛋白是酶，结构已经解析出来了，催化肽键断裂。
预测的催化三联体中2个残基出现在活性中心，另外一个残基（x）离活性中心很远，通
过序列比对确定这个远离的残基就是催化三联体之一，很保守。如果是变构结合的话，
我用itc测了好几个底物也看不见结合放热。和已知的同源结构进行结构比对，也发现
那2个残基位置都对应，就是x很不对。我怀疑有没有可能是Zymogen，或者需要啥附因
子之类的激活它。没经验啊，希望大家给点意见，小弟还指望这个毕业呢。多谢多谢 |
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d******1
发帖数: 709 | 41 有了结构，复合体不是小case一个么？把晶体浸在底物里面，多来几次，总会看到一片
云的。结合放热并不是每次都能看见的，有些构象变化天生没有热量变化。用NMR，SPR
看看吧。 |
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x***o
发帖数: 47 | 42 这个就很难泡，而且到现在也没有文章报道过和底物的复合物，单体倒是很多
SPR |
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x***o
发帖数: 47 | 43 我的结构没有突变，而且itc结果又突变的也有native的，都没有显示结合，我怀疑做
cd之类的也不会有明显变化，谢谢，呵呵，不管怎样，下一步尝试尝试
来帮楼主分析一下。
因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保
守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。 |
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g*********r
发帖数: 9366 | 44 你说的对
绝不能仅仅从sequence alignment上找active site , 有的保守点是提供其他功能，比
如substrate binding , co factor binding, 或者结构支撑所必须，甚至是演化中的
冗余
判断catalytical center，如果没有类似的已知information, 必须有mutant /
activity assay 佐证
来帮楼主分析一下。
因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保
守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。 |
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d******1
发帖数: 709 | 45 ref.不记得了，你可以去找找，躲在一些物理化学的小杂志里面。
ITC，什么都没看到，有太多的可能性了。
以下有几种可能性。
1：200ul的ITC一般什么都看不到，用4ml的老ITC。
2.换成磷酸溶液。
3. 升高蛋白和底物的溶度。 |
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n**8
发帖数: 221 | 47 没做过这个，但如果我是你，我会试试这两个条件，
1.) ATP analog
2.）实在不行，就crosslink，这个要设计好control。 |
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a*****x
发帖数: 901 | 48 一般做in vitro phosphorylation |
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p*****u
发帖数: 191 | 50 vitro phosphorylation必须顶这个 |
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