B***v 发帖数: 113 | 1 1. 现在质谱的灵敏度有多高了,一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗?我记得以前起
码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。
2. 用质谱做全细胞proteomics定量,信号是否很难解析?因为一些house keeping
protein量太大,会干扰其他量低的蛋白的信号?
3. 用质谱比较两个蛋白的表达量是否准确,比如说信号强度1:5,蛋白量也是1:5?我
以前的经验是蛋白量远大于这个比例,比如1:100 | Y****U 发帖数: 3 | 2 1. 可以
2. 你提的问题是存在的,但是现在蛋白组的覆盖率已经很高了,通常覆盖几千个蛋白
不成问题,但极低丰度的蛋白仍然难以被检测。
3. 基于同位素标记的手段最准确,非标记定量也有很多人在用了。通常有一些
normalization的手段,直接看信号强度不太准确。 | K******S 发帖数: 10109 | 3 1. 20Kd 和200 Kd的就差10倍, 看你是什么蛋白了,氨基酸序列是否好离子化。一般来
说没问题。
2. 你是指相对定量还是绝对定量?
3. 不同蛋白的质谱信号不能做定量比较的
:1. 现在质谱的灵敏度有多高了,一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗?我记得以前
起码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。
: | g*****x 发帖数: 3283 | 4
pico mole is enough, but this depends on how complex your sample is. If you
know what your target is, instead of doing shotgun proteomics, you can
develop a targeted method so the sensitivity can be improved by 5-10x.
For full cell lysate sample, if you wanna do ultra-deep discovery and
quantification, routinely you need to do fractionating (sec, iex, gelfree)
before digestion.
On current MS instrument, data-dependent acquisition can do dynamic or
static exclusion for the peptide precursors, so peptides from high-abundance
protein will not cover the signals from other peptides.
Depends on your instrument and quantification method, as well as your sample
.
Based on my experience in label-free quantification, the ratio is still
accurate within 2 orders of magnitude dynamic range.
【在 B***v 的大作中提到】 : 1. 现在质谱的灵敏度有多高了,一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗?我记得以前起 : 码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。 : 2. 用质谱做全细胞proteomics定量,信号是否很难解析?因为一些house keeping : protein量太大,会干扰其他量低的蛋白的信号? : 3. 用质谱比较两个蛋白的表达量是否准确,比如说信号强度1:5,蛋白量也是1:5?我 : 以前的经验是蛋白量远大于这个比例,比如1:100
| n********0 发帖数: 11 | 5 你说的dda 的exclusion list 效果能有多好呢?而且他要是定量的话,你的
housekeeping 蛋白都exclusive了 还怎么能相对定量?
应该是dia吧 data 全记录。
2. 用质谱做全细胞proteomics定量,信号是否很难解析?因为一些house keeping
For full cell lysate sample, if you wanna do ultra-deep discovery and
quantification, routinely you need to do fractionating (sec, iex, gelfree)
before digestion.
On current MS instrument, data-dependent acquisition can do dynamic or
static exclusion for the peptide precursors, so peptides from high-abundance
protein will not cover the signals from other peptides. | g*****x 发帖数: 3283 | 6
LFQ用的是MS1的intensity进行定量,MS2只起到identification的作用。所以只要
retention time和mass从MS2中得到了确认,就可以从MS1中得到相当完整的intensity
信息。
如果你打算做MS2-based的定量,当然不能用dynamic exclusion。
abundance
【在 n********0 的大作中提到】 : 你说的dda 的exclusion list 效果能有多好呢?而且他要是定量的话,你的 : housekeeping 蛋白都exclusive了 还怎么能相对定量? : 应该是dia吧 data 全记录。 : 2. 用质谱做全细胞proteomics定量,信号是否很难解析?因为一些house keeping : For full cell lysate sample, if you wanna do ultra-deep discovery and : quantification, routinely you need to do fractionating (sec, iex, gelfree) : before digestion. : On current MS instrument, data-dependent acquisition can do dynamic or : static exclusion for the peptide precursors, so peptides from high-abundance : protein will not cover the signals from other peptides.
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