s******y
发帖数: 17729 | |
x****6
发帖数: 4339 | 2 这突变逆天了，看表格里，有些位点突变的频率比野生型的还大。最坏的情况比野生型
随机突变高一个数量级。不过也要看gRNA的选择。
这个Off-target早就不是什么新鲜事了，不过这片文章比以前的似乎更加negative。
【在 s******y 的大作中提到】
: 没人讨论一下？
: 看不到全文，看了下摘要
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c********6
发帖数: 693 | 3 这篇文章说明以前很多发表的关于CRISPR的文章存在严重的数据偏好筛选的现象。很想
提议之前的实验室将所得到的edited的细胞系全部递交到ATCC，让权威机构对这些细胞
进行全部测序，包括那几个大牛实验室，现在的东西实在是吹嘘的太厉害而忘记了去正
视技术本身存在的缺陷。
我一直都认为这种结果的文章一定是真实的，只要有unwanted的突变，就表明了技术本
身就是有问题，除非他们的测序公司有技术上的失误。有人会跳出来说他用了质粒或者
只用了一个guideRNA，甚至会说他选的target特异不高，试图推翻这篇文章的结论，但
是你去看看之前的文章，有几篇不是用的质粒，有几篇不是用的一个guideRNA， 又有
几篇客观报道off-target。这篇文章估计是绕开了几个编辑大牛的review，这很好，
Nature Methods终于做了一次正确的事情。 |
r***z
发帖数: 19 | 4 我一直很好奇，有没有人算过针对Human或者Mouse 的genome，off-target 最高的是哪
个sgRNA？或者针对Human/Mouse 的 coding region, off-target 最高的又是哪个
sgRNA.？ |
C*********n
发帖数: 1032 | |
l***y
发帖数: 638 | 6 总共测了三只老鼠，两只是zygote打了gRNA的，是不是一个founder出来的没说所以不清
楚，control就是随便笼子里捉了只没打过的，结果是不是靠谱先不去说，就这个实验设
计也是挺神的，现在发文章都是靠概念，科学素养神马的都是浮云了
【在 s******y 的大作中提到】
: 没人讨论一下？
: 看不到全文，看了下摘要
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c********6
发帖数: 693 | 7 我倒不那么认为，我不觉得作者会那么low。问题是人家就那么随随便便一测就能发现
如此多的随机突变，这个从概率上来说，已经可以说明问题了。不要因为不喜欢别人的
结果而坚持要推翻别人的结论。
在supplementary的数据中写道：FVB/NJ mice, which are inbred and homozygous
for the retinal degeneration 1 (rd1) allele of Pde6b, were purchased from
The Jackson Laboratory, (Bar Harbor, ME). Co-housed FVB/NJ mice without
CRISPR-mediated correction were used as the functional-deficient control.
Briefly, an sgRNA- expressing plasmid had been coinjected, into FVB/NJ
zygotes, with the single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor
template and Cas9 protein to generate mosaic F0 founders.
不清
验设
【在 l***y 的大作中提到】
: 总共测了三只老鼠，两只是zygote打了gRNA的，是不是一个founder出来的没说所以不清
: 楚，control就是随便笼子里捉了只没打过的，结果是不是靠谱先不去说，就这个实验设
: 计也是挺神的，现在发文章都是靠概念，科学素养神马的都是浮云了
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D*a
发帖数: 6830 | 8 你忘了老鼠都是纯系的了吧，是不是一个founder有什么要紧？
又不是下水道里捉三只老鼠
不清
验设
【在 l***y 的大作中提到】
: 总共测了三只老鼠，两只是zygote打了gRNA的，是不是一个founder出来的没说所以不清
: 楚，control就是随便笼子里捉了只没打过的，结果是不是靠谱先不去说，就这个实验设
: 计也是挺神的，现在发文章都是靠概念，科学素养神马的都是浮云了
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d********m
发帖数: 3662 | 9 Rats' queen is here. I am convinced.
【在 D*a 的大作中提到】
: 你忘了老鼠都是纯系的了吧，是不是一个founder有什么要紧？
: 又不是下水道里捉三只老鼠
:
: 不清
: 验设
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m*********D
发帖数: 1727 | 10 没用CRISPR作过动物。记得是直接注射sgRNA/Cas9 mRNA到受精卵里面？测DNA序列就是
尾巴拿一节下来提genomic DNA？这个过程我有点担心的是，Cas9是在受精卵水平就发
生了，还是在后面一段时间里都可能发生。我个人在细胞水平作的时候，有这个考虑，
就是Plamisd（含guide/Cas9/HDR-template)transfect到细胞之后，等了五天，再
split，然后等单克隆。我担心的就是一个细胞接受了plasmid，但这个cas9/HDR过程不
是马上发生，不等几天（我个人经验是expression plasmid表达的基因至少有四天往上
的活性）split，很可能挑出来的克隆是不单一的。
我五天后split，挑的单克隆里，有一个克隆至少后面confirm了，是一个single-
replacement/double-replacement的mix。这个之所以发现了，是因为single-
replacement的细胞最后长得快，过了两个月发现表型有些不一样，再作genotyping，
才确定的。回头看了我两个月前的genotyping图片，确实有一条很不明显的条带，当时
以为是酶切不完全。就因为这个克隆，我文章送出去后，revision多花了两个月，另找
一个克隆，重新作试验。这个可以解释成cas9/HDR在两个基因拷贝上发生的时间不一样
，也可能就是两个克隆没有分开。后面这个可能性比较小，因为我一个100 mm的平板上
，克隆不多，就十几个。
我知道在发育生物学上，老鼠尾巴的细胞来源很可能在胚胎早期是同源的。但如果cas9
/guide表达时间足够长，胚胎早期细胞分裂快，会不会这些尾巴细胞也可能是不完全一
样？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 11 没钱和时间，不然我可以作一个whole genome sequencing来比较的--我有四种100%
sure完全不同的克隆，用的是同样的guide sequences,但不同的HDR-template。一种里
面挑一个克隆出来sequencing，应该可以回答一些我上面的问题。但对我们实验室，没
有什么意义。 |
m****a
发帖数: 270 | 12 Cas9 表达得越久越多，当然 产生的 off target 越多。
这篇文章最恶心的地方就是注射受精卵同时用了Cas9的质粒和Cas9 蛋白，明知故犯不
可思议。
但是一想也对，作者的动机不就是要 off target多好搞个大文章么？
应该去查查这几个人有没有在做空几个CRISPR相关股票。
看到过相关文献转染细胞24h的时候编辑大部分已经完成了，48h略有增加，48h到72h基
本没再增加。所以一般的protocol就推荐转染后两天split。
质粒的问题在于持续长时间的表达会增加off target 的概率。所以不如用蛋白，进入
细胞立即起作用，作用完以后就降解。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 没用CRISPR作过动物。记得是直接注射sgRNA/Cas9 mRNA到受精卵里面？测DNA序列就是
: 尾巴拿一节下来提genomic DNA？这个过程我有点担心的是，Cas9是在受精卵水平就发
: 生了，还是在后面一段时间里都可能发生。我个人在细胞水平作的时候，有这个考虑，
: 就是Plamisd（含guide/Cas9/HDR-template)transfect到细胞之后，等了五天，再
: split，然后等单克隆。我担心的就是一个细胞接受了plasmid，但这个cas9/HDR过程不
: 是马上发生，不等几天（我个人经验是expression plasmid表达的基因至少有四天往上
: 的活性）split，很可能挑出来的克隆是不单一的。
: 我五天后split，挑的单克隆里，有一个克隆至少后面confirm了，是一个single-
: replacement/double-replacement的mix。这个之所以发现了，是因为single-
: replacement的细胞最后长得快，过了两个月发现表型有些不一样，再作genotyping，
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x****6
发帖数: 4339 | 13 “ 这篇文章最恶心的地方就是注射受精卵同时用了Cas9的质粒和Cas9 蛋白”
多加一个Cas9来源等于提高其表达水平，如果这都能make a huge difference,那本来
就证明这个系统不可靠。
蛋白在细胞里的寿命和从质粒上表达的多少是有很大波动空间的，纯质粒表达或者纯蛋
白注射在细胞里的浓度方差应该是不小的，那么也存在off target的风险。
比如两个一起用造成1000个突变和单个使用造成500个突变，在临床上都是不可靠。
【在 m****a 的大作中提到】
: Cas9 表达得越久越多，当然 产生的 off target 越多。
: 这篇文章最恶心的地方就是注射受精卵同时用了Cas9的质粒和Cas9 蛋白，明知故犯不
: 可思议。
: 但是一想也对，作者的动机不就是要 off target多好搞个大文章么？
: 应该去查查这几个人有没有在做空几个CRISPR相关股票。
: 看到过相关文献转染细胞24h的时候编辑大部分已经完成了，48h略有增加，48h到72h基
: 本没再增加。所以一般的protocol就推荐转染后两天split。
: 质粒的问题在于持续长时间的表达会增加off target 的概率。所以不如用蛋白，进入
: 细胞立即起作用，作用完以后就降解。
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k****z
发帖数: 1863 | |
m****a
发帖数: 270 | 15 药还有个剂量，吃适量的量能治病，吃多了会挂。
CRISPR off-target 不是什么新闻了，直接在体编辑风险比体外编辑好了再输回去风险
大。
对于快挂的人来说，只要风险可控，收益远大于风险就值得一试。
1000个突变也就是这篇文章的新发现，缺少合理的解释。
是否可信也得需要设计更多的实验来验证。
【在 x****6 的大作中提到】
: “ 这篇文章最恶心的地方就是注射受精卵同时用了Cas9的质粒和Cas9 蛋白”
: 多加一个Cas9来源等于提高其表达水平，如果这都能make a huge difference,那本来
: 就证明这个系统不可靠。
: 蛋白在细胞里的寿命和从质粒上表达的多少是有很大波动空间的，纯质粒表达或者纯蛋
: 白注射在细胞里的浓度方差应该是不小的，那么也存在off target的风险。
: 比如两个一起用造成1000个突变和单个使用造成500个突变，在临床上都是不可靠。
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x****6
发帖数: 4339 | 16 从科学上，应该找出编辑（Knockout/in）效率和crispr/cas9表达强度之间，突变数目
和crispr/cas9表达强度之间的两种关系，然后找到最佳的保持高效率编辑和低风险突
变的表达水平。
药的剂量基本上也是这么确定的。
你强调编辑效率，文章强调风险，都没错，但是具体的平衡要做实验来决定。
我从局外人来看，任何新兴又流行的事物都会遵循一个社会学意义上的gardner's hype
cycle。crispr有过热的症状，现在可能是稍微熄点火的时候，很正常。
另外，请你举一个crispr/cas用来救垂危病人的例子。
【在 m****a 的大作中提到】
: 药还有个剂量，吃适量的量能治病，吃多了会挂。
: CRISPR off-target 不是什么新闻了，直接在体编辑风险比体外编辑好了再输回去风险
: 大。
: 对于快挂的人来说，只要风险可控，收益远大于风险就值得一试。
: 1000个突变也就是这篇文章的新发现，缺少合理的解释。
: 是否可信也得需要设计更多的实验来验证。
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a*****l
发帖数: 244 | 17 做老鼠没问题啊。。。不停和WT杂交，只要不是和目标基因偶联的off-target都会被杂
交掉。细胞系就没有这么容易搞掉offtarget了。 |
a*********n
发帖数: 390 | 18 比如用于huntington疾病的治疗？
hype
【在 x****6 的大作中提到】
: 从科学上，应该找出编辑（Knockout/in）效率和crispr/cas9表达强度之间，突变数目
: 和crispr/cas9表达强度之间的两种关系，然后找到最佳的保持高效率编辑和低风险突
: 变的表达水平。
: 药的剂量基本上也是这么确定的。
: 你强调编辑效率，文章强调风险，都没错，但是具体的平衡要做实验来决定。
: 我从局外人来看，任何新兴又流行的事物都会遵循一个社会学意义上的gardner's hype
: cycle。crispr有过热的症状，现在可能是稍微熄点火的时候，很正常。
: 另外，请你举一个crispr/cas用来救垂危病人的例子。
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a*********n
发帖数: 390 | 19 三哥的数据要打个折再看的，听他们忽悠保证你什么实验也做不出来 |
m*********D
发帖数: 1727 | 20 镰刀性贫血症，通过干细胞好像在作了？还有那个艾滋病，白人里有1%的人是天然带一
种突变，病毒不能感染，这个点突变应该可以通过干细胞改造来完成。
上面各位，CRISPR的off-target不是新鲜事，不然就不会有人作那个Cas9n了。这个是
切一条DNA链的，一个切点不会出现DBS,就没有indel了。只有设计的两个guide-seq比
较接近（200bp以内？）时，才有可能出现DBS,才有修补和突变的机会。这个应该大量
减少off-target的突变。
【在 a*********n 的大作中提到】
: 比如用于huntington疾病的治疗？
:
: hype
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x****6
发帖数: 4339 | 21 从HDR的原理看，Nickase在单链上造成的缺口，在修复的时候是使用特殊的TLS聚合酶
来实现,这是一个易出错的过程。所以也不干净。只是看拿它和NHEJ比较是不是出错率
显著的小一些。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 镰刀性贫血症，通过干细胞好像在作了？还有那个艾滋病，白人里有1%的人是天然带一
: 种突变，病毒不能感染，这个点突变应该可以通过干细胞改造来完成。
: 上面各位，CRISPR的off-target不是新鲜事，不然就不会有人作那个Cas9n了。这个是
: 切一条DNA链的，一个切点不会出现DBS,就没有indel了。只有设计的两个guide-seq比
: 较接近（200bp以内？）时，才有可能出现DBS,才有修补和突变的机会。这个应该大量
: 减少off-target的突变。
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D*a
发帖数: 6830 | 22 如果不能控制脱靶，治单基因疾病是够呛吧，修复了一个位点突变出其他十个driver
genes，全身长瘤子，一样是死，说不定死得还快些...
【在 m****a 的大作中提到】
: 药还有个剂量，吃适量的量能治病，吃多了会挂。
: CRISPR off-target 不是什么新闻了，直接在体编辑风险比体外编辑好了再输回去风险
: 大。
: 对于快挂的人来说，只要风险可控，收益远大于风险就值得一试。
: 1000个突变也就是这篇文章的新发现，缺少合理的解释。
: 是否可信也得需要设计更多的实验来验证。
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w***a
发帖数: 4361 | 23 张峰肯定会repeat三哥的paper，没准过几个月就出来打脸了。
EDIT股票跟三个月前比已经腰斩了。
【在 D*a 的大作中提到】
: 如果不能控制脱靶，治单基因疾病是够呛吧，修复了一个位点突变出其他十个driver
: genes，全身长瘤子，一样是死，说不定死得还快些...
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m*********D
发帖数: 1727 | 24 张峰应该找我，我昨天数了数，我有至少八个100￥sure不同的克隆，都是用了两个
Guide Sequences但不同的HDR template出来的，只要whole genome sequencing，大约
就知道答案了。：）。
我是用细胞作的CRISPR/HDR来create mutation,，和干细胞genetic校正后再放回病人
体内治病更相近一些。
:))).
【在 w***a 的大作中提到】
: 张峰肯定会repeat三哥的paper，没准过几个月就出来打脸了。
: EDIT股票跟三个月前比已经腰斩了。
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d********m
发帖数: 3662 | 25 why don't you reach out to him directly? might be a chance of your life
【在 m*********D 的大作中提到】
: 张峰应该找我，我昨天数了数，我有至少八个100￥sure不同的克隆，都是用了两个
: Guide Sequences但不同的HDR template出来的，只要whole genome sequencing，大约
: 就知道答案了。：）。
: 我是用细胞作的CRISPR/HDR来create mutation,，和干细胞genetic校正后再放回病人
: 体内治病更相近一些。
: :))).
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m*********D
发帖数: 1727 | 26 呵呵，那倒没必要，我争取在这里干到退休。。。
我自己对这个off-target突变也有些兴趣。全实验室的 project都是围绕这些cell
line。但一个问题就是这些line有没有off-target的其他突变啊。所以，我也不是完全
无私。和老板聊了我的想法，老板哈哈大笑，我们自己肯定没人力物力作，但张峰有兴
趣倒是可以给。。。
说说而已。真有off-target，我们不是太在乎。我们不是作技术的，会有其他方法来验
证我们的mutant的功能。
【在 d********m 的大作中提到】
: why don't you reach out to him directly? might be a chance of your life
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c********9
发帖数: 562 | 27 赞老哥的心态
最近有没有去钓鱼?
【在 m*********D 的大作中提到】
: 呵呵，那倒没必要，我争取在这里干到退休。。。
: 我自己对这个off-target突变也有些兴趣。全实验室的 project都是围绕这些cell
: line。但一个问题就是这些line有没有off-target的其他突变啊。所以，我也不是完全
: 无私。和老板聊了我的想法，老板哈哈大笑，我们自己肯定没人力物力作，但张峰有兴
: 趣倒是可以给。。。
: 说说而已。真有off-target，我们不是太在乎。我们不是作技术的，会有其他方法来验
: 证我们的mutant的功能。
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m*********D
发帖数: 1727 | 28 去了。上礼拜钓了两天，一百多crappie，还换了一瓶酒回家。明天儿子说跟我去。这
个周末不用去实验室，又可以钓两天鱼。。。
【在 c********9 的大作中提到】
: 赞老哥的心态
: 最近有没有去钓鱼?
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c********9
发帖数: 562 | 29 哇，crappie 100多，难得难得。
厉害啊。
我是钓到bass 就很满意了。
去了。上礼拜钓了两天，一百多crappie，还换了一瓶酒回家。明天儿子说跟我去。这
个周末不用去实验室，又可以钓两天鱼。。。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 去了。上礼拜钓了两天，一百多crappie，还换了一瓶酒回家。明天儿子说跟我去。这
: 个周末不用去实验室，又可以钓两天鱼。。。
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t*******w
发帖数: 107 | 30 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28557981/#comments
FYI all.
Xiaolin Wu2017 May 31 2:11 p.m. (6 days ago) 9 of 9 people found this
helpful
This paper raises important safety issue for gene therapy application of
CRISPR-Cas9. However, there are serious doubts about the results or
interpretation. First of all, the authors listed Top-10 predicted off-target
sites. But all genes are wrong! looking at the sequence they listed (supp.
figure 3), you will not be able to find it in the genes! After careful
inspection, the first predicted off-target is actually the "on-target"
sequence for pde6b gene. For such a high-profile journal, you can't be so
sloppy. This is not just a typo. I inspected them and they are all assigned
to wrong gene. If you can't even get your on-target correct, how do you
think people can trust your data? There are some genes are assigned to even
wrong chromosomes! Supp fig3 panel b, listed herc1 gene on ch11. That gene
is supposed to be on chr9. After this first figure, I don't even know if any
other information reported here is correct!
I then went on to inspect Supp table 1-3. The authors listed all off-targets
observed from the WGS. However, Pde6b pTyr347fs/c1041_1050CGTAGCAGAA is
actually the on-target indel. and the author did not even notice this is
their target gene? and listed it as one of the two off-target genes with
mouse phenotype? The CRISPR-cas9 system is supposed to created Indel here!
You simply did not repair it. You replaced the stop codon with the indel. I
downloaded the raw sequence, and found that this specific deletion (
CTGAGCAGAA)can not be found. Only by reading the authors previous paper, I
figured out that they mean a 10 bp deletion but they don't even have the
correct deletion sequence!
After seeing all these careless mistakes, I don't even know if they
mislabeled the mouse or samples! It is hard for me to imagine CRISPR-case9
causes so many homozygous deletions in two independent mice (all right, it
may happen in rare case for specific sgRNA like this one). And even if some
of the mutations/indels are real, they may have nothing to do with CRISPR-
cas9. For example, the authors see homozygous deletion in Pde9a gene in both
animals. Do the authors consider the possibility that this deletion might
be created by totally unrelated mechanisms and strongly selected for in vivo
? since Pde9a and pde6b are paralogues. The easiest way to test if these are
real CRISPR-cas9 off-target is to check these loci in treated cells in
vitro. In that setting, you can check millions of cells to see if they do
occur or do not occur. Maybe none of them is created by CRISPR-cas9 off-
target. But during the embryo development, these mutations are created and
strongly selected to compensate for something. I admit that in vitro does
not speak for in vivo. But you can't just assume these mutations are
generated by CRISPR-Cas9. |
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D***s
发帖数: 5613 | 31 又是基因list有问题，难道又是一个Anil Potti?
target
.
【在 t*******w 的大作中提到】
: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28557981/#comments
: FYI all.
: Xiaolin Wu2017 May 31 2:11 p.m. (6 days ago) 9 of 9 people found this
: helpful
: This paper raises important safety issue for gene therapy application of
: CRISPR-Cas9. However, there are serious doubts about the results or
: interpretation. First of all, the authors listed Top-10 predicted off-target
: sites. But all genes are wrong! looking at the sequence they listed (supp.
: figure 3), you will not be able to find it in the genes! After careful
: inspection, the first predicted off-target is actually the "on-target"
|
j****n
发帖数: 3370 | 32 这么低级错误的文章居然发在nature methods？
target
.
【在 t*******w 的大作中提到】
: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28557981/#comments
: FYI all.
: Xiaolin Wu2017 May 31 2:11 p.m. (6 days ago) 9 of 9 people found this
: helpful
: This paper raises important safety issue for gene therapy application of
: CRISPR-Cas9. However, there are serious doubts about the results or
: interpretation. First of all, the authors listed Top-10 predicted off-target
: sites. But all genes are wrong! looking at the sequence they listed (supp.
: figure 3), you will not be able to find it in the genes! After careful
: inspection, the first predicted off-target is actually the "on-target"
|
c********6
发帖数: 693 | 33 搞不懂那些人为什么一上来就很人生攻击这个文章的作者，尤其是那个叫Wu的人在
Pubmed上面长篇大论说人家这里不好那里不好，很是义愤填膺，不知道这些人是什么心
态。
在我感觉测序是什么样的结果就是什么样的，哪有那么多control不对。 |
