Dual luciferase的内参问题 - Biology版 - 未名存档

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Biology版 - Dual luciferase的内参问题

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r**********e 发帖数: 587	1 在用psicheck2这个dual luciferase研究我的5‘UTR的SNP对于基因表达的影响； Renilla和Firefly都是在一个plasmid上的，但被两个不同的promoter驱动。5’UTR放在Renilla前面，而Firefly作为internal control可以控制sample amount之类的因素 Plasmid1: PromoterA---5'UTR-SNP1---Renilla---PromoterB---Firefly Plasmid2: PromoterA---5'UTR-SNP2---Renilla---PromoterB---Firefly 现在的问题是，我用“同样量”的Plasmid1和Plasmid2来转染，也是大致“同样数量” 的细胞，可总是发现Plasmid1的Firefly level总是Plasmid2的两倍多；换句话说，我觉得我作为internal control的Firefly也受到SNP的影响。另外，其实我的这个5'UTR是类似G-quadruplex的区域，大概2KB（占了整个plasmid的1 /4），我很肯定这个5‘UTR是形成复杂的高级结构的，我在想会不会这个本身结构很复杂的5’UTR影响到了整个plasmid的空间结构，所以导致这个所谓的内参很不合适，压根不能作为control 所以应该用GAPDH来作为内参么？
S**********e 发帖数: 620	2 双荧光是荧光实验最好的参照，如果有问题只能调整比例，再有问题只能用别的办法了，不过或许你的结果是对的。
r**********e 发帖数: 587	3 我想问一下，那么用单荧光单人，都是如何进行control的呢？可以用gapdh这种内参来control细胞的量然后转染的时候很小心的用equimolar amount的plasmid保证转染进去的量是一样的我们用同样的细胞的量，同样的plasmid的量去转染，那么firefly的表达量也应该是一样的吧？【在 S**********e 的大作中提到】 : 双荧光是荧光实验最好的参照，如果有问题只能调整比例，再有问题只能用别的办法了 : ，不过或许你的结果是对的。

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