i********y
发帖数: 23 | 1 大家好，
这个星期第一次做CHIP.完整的protocol就不贴了，但：
1. reverse crosslink 在65℃上热了16个小时。
2. 然后加proteinaseK在37℃热了2个小时。
3. 纯化DNA用的是phenol/chlorofoam.做这一步的时候有点怪。加了phenol/
chlorofoam然后spin down，可以看到aqueous layer和organic layer,但中间的那层
lipid layer基本上就没有。
最奇怪的是phenol/chlorofoam的最后几步。我把aqueous layer提出后加ethanol+NaCl
+glycogen, 然后放零下80℃三个小时后spin down, 居然看到一个有我半个小拇指指甲
大的白色的precipitate.当时我就觉得有点不对劲。但我用70%ethanol洗了一遍之后，
这个precipitate的体积马上减少了90%多，颜色也变蓝了（我们用的glycogen是蓝色的
glycoblue).之后我再洗了一遍。
最后我用nanodrop测，发现所有sample的260/280都只有1.0左右。不知道有哪个大神能
够看看究竟出了什么问题？谢谢。 |
k*****n
发帖数: 323 | 2 rc @ 65c 6h-o/n with proteinase k。抽提一次即可，不要抽到下面的有机相。 |
m******5
发帖数: 1383 | 3 transcription factor? histon?
nanodrop通常不能测chipdna浓度这么低的东西
NaCl
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 这个星期第一次做CHIP.完整的protocol就不贴了，但：
: 1. reverse crosslink 在65℃上热了16个小时。
: 2. 然后加proteinaseK在37℃热了2个小时。
: 3. 纯化DNA用的是phenol/chlorofoam.做这一步的时候有点怪。加了phenol/
: chlorofoam然后spin down，可以看到aqueous layer和organic layer,但中间的那层
: lipid layer基本上就没有。
: 最奇怪的是phenol/chlorofoam的最后几步。我把aqueous layer提出后加ethanol+NaCl
: +glycogen, 然后放零下80℃三个小时后spin down, 居然看到一个有我半个小拇指指甲
: 大的白色的precipitate.当时我就觉得有点不对劲。但我用70%ethanol洗了一遍之后，
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a******r
发帖数: 786 | 4 你pK 2小时37度是不是有点不够？
我记得怎么也得55度一小时吧 |
K**R
发帖数: 193 | 5
NaCl
水平有限， 根据我经验是，
reverse 16有点长，12小时可以。
楼上朋友说对，37度是用RNAase消化的，PK至少50 2hr
最后纯化我没用过传统方法，都是zymo 的ChIP Kit 很方便
还有就是inspect自己抗体是不是effective pulldown targets
第二，检测自己beads 是protein G或者A? 因为根据一抗而定，有些primary 对G敏感
，对A差
反之毅然
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 这个星期第一次做CHIP.完整的protocol就不贴了，但：
: 1. reverse crosslink 在65℃上热了16个小时。
: 2. 然后加proteinaseK在37℃热了2个小时。
: 3. 纯化DNA用的是phenol/chlorofoam.做这一步的时候有点怪。加了phenol/
: chlorofoam然后spin down，可以看到aqueous layer和organic layer,但中间的那层
: lipid layer基本上就没有。
: 最奇怪的是phenol/chlorofoam的最后几步。我把aqueous layer提出后加ethanol+NaCl
: +glycogen, 然后放零下80℃三个小时后spin down, 居然看到一个有我半个小拇指指甲
: 大的白色的precipitate.当时我就觉得有点不对劲。但我用70%ethanol洗了一遍之后，
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i********y
发帖数: 23 | |
