D***a 发帖数: 516 | 1 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里,有大有小,大的5k,小的0.3k。在293T细胞
里和包装质粒共表达做病毒,之后感染HeLa,再用puro筛。没感染的细胞都杀死了,感
染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光,转了小基因的细胞只有1%的是阳性,转大基因
的细胞都是阴性。westernblot也做了,小基因的能弱弱的看见,大基因的是阴性。质
粒序列没问题。
为什么puro抗性转进去了,我的基因转不进去?需要经验丰富的专家解答,谢谢。 |
s******s 发帖数: 13035 | 2 puro和你的gene是2A在一起的,还是独立的
【在 D***a 的大作中提到】 : 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里,有大有小,大的5k,小的0.3k。在293T细胞 : 里和包装质粒共表达做病毒,之后感染HeLa,再用puro筛。没感染的细胞都杀死了,感 : 染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光,转了小基因的细胞只有1%的是阳性,转大基因 : 的细胞都是阴性。westernblot也做了,小基因的能弱弱的看见,大基因的是阴性。质 : 粒序列没问题。 : 为什么puro抗性转进去了,我的基因转不进去?需要经验丰富的专家解答,谢谢。
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D***a 发帖数: 516 | |
D***a 发帖数: 516 | 4 我用过别的lentiviral vector过表达GFP和其他蛋白,没有selection marker,但我能
得到细胞几乎100%阳性。我认为我做病毒的方法是没问题的。 |
j******i 发帖数: 939 | 5 如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话 在293T细胞里会得到大量的不完整的
viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的
stable
【在 D***a 的大作中提到】 : 独立的吧,我用的是这个载体 : http://www.addgene.org/39481/ : 在网上找到有人和我遇到一样的问题: : https://www.researchgate.net/post/What_to_do_with_a_false_positive_in_stable : _cell_select
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D***a 发帖数: 516 | 6 谢谢。 我的基因只有coding sequence。会不会是转293T时候vortex把载体弄断了?会
产生这种问题吗?
【在 j******i 的大作中提到】 : 如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话 在293T细胞里会得到大量的不完整的 : viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的 : : stable
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D***a 发帖数: 516 | 7 另外,我突发奇想,可不可以在hela细胞转染lentiviral载体和表达integrase的质粒
,是不是也能整合到基因组里面去? |
j******i 发帖数: 939 | 8 如果只有coding sequence的话 应该用2A或者IRES链接puro 否则的话 目的基因可能和
puro相互影响
【在 D***a 的大作中提到】 : 谢谢。 我的基因只有coding sequence。会不会是转293T时候vortex把载体弄断了?会 : 产生这种问题吗?
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D***a 发帖数: 516 | 9 我用的是这个载体,能帮我看一下吗?加在bamHI和XhoI之间
http://www.addgene.org/39481/
【在 j******i 的大作中提到】 : 如果只有coding sequence的话 应该用2A或者IRES链接puro 否则的话 目的基因可能和 : puro相互影响
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h***e 发帖数: 7320 | |
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j******i 发帖数: 939 | 11 这个载体本身的设计非常糟糕 能不用的话就不要用了 我看了一下 首先是缺了WPRE元
件 再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰
【在 D***a 的大作中提到】 : 我用的是这个载体,能帮我看一下吗?加在bamHI和XhoI之间 : http://www.addgene.org/39481/
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D***a 发帖数: 516 | 12 太感谢了。能推荐一个addgene的载体吗?
【在 j******i 的大作中提到】 : 这个载体本身的设计非常糟糕 能不用的话就不要用了 我看了一下 首先是缺了WPRE元 : 件 再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰
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j******i 发帖数: 939 | 13 Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9, 然后
把启动子+你的目的基因放进去(不加polyA),后面正好跟着2A和puro。
【在 D***a 的大作中提到】 : 太感谢了。能推荐一个addgene的载体吗?
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D***a 发帖数: 516 | 14 太感谢了。手里有这个质粒。
【在 j******i 的大作中提到】 : Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9, 然后 : 把启动子+你的目的基因放进去(不加polyA),后面正好跟着2A和puro。
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D***a 发帖数: 516 | 15 再问一个,是不是要把我的基因的stop codon去掉?
【在 j******i 的大作中提到】 : Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9, 然后 : 把启动子+你的目的基因放进去(不加polyA),后面正好跟着2A和puro。
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j******i 发帖数: 939 | 16 是的
【在 D***a 的大作中提到】 : 再问一个,是不是要把我的基因的stop codon去掉?
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j****x 发帖数: 1704 | 17 "两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达"这个问题不大,有些很成熟的商用载体也
是这么干的。我以前做过几个细胞系,不同的基因都表达的很正常。
慢病毒载体插入5kb的片段,包装效率很可能会比包装1kb以下的差出2个数量级以上。
但考虑到小基因的表达也很弱,应该是载体本身有存在系统系的问题,WPRE元件缺失应
该是可能性之一。只是好奇,设计载体的人居然连这点都没考虑到。
【在 j******i 的大作中提到】 : 这个载体本身的设计非常糟糕 能不用的话就不要用了 我看了一下 首先是缺了WPRE元 : 件 再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰
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