p*******r 发帖数: 59 | 1 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗?
Cutting cas9 的off-target 可能性大吗?
293T细胞如果有90%的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有
多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做
一下预实验看看基因作用?像siRNA一样用?
有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的?
Thanks! |
t**l 发帖数: 109 | 2 看你的实验目的了,如果你的实验结果是在293T上做,phenotype可以快速的看到,可
以不做筛选。但是这样的phenotype并不是KO.我觉得如果想快速的看看是否有作用,可
以。但是早晚还是要pick single cell clone. 来验证。要不是CRISPR这个技术就浪费
了。除非你是做screen. |
s******s 发帖数: 13035 | 3 我道听途说,只要能转进去,据说knockout接近100%
我不负责是否正确
【在 p*******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗? : Cutting cas9 的off-target 可能性大吗? : 293T细胞如果有90%的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有 : 多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做 : 一下预实验看看基因作用?像siRNA一样用? : 有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的? : Thanks!
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a***y 发帖数: 19743 | 4 感觉不错,可以考虑设计使用crispr或talen的实验…
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我道听途说,只要能转进去,据说knockout接近100% : 我不负责是否正确
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D***a 发帖数: 516 | 5 是不是现在有了CRISPR,还在用shRNA就已经过时了?比如我想干扰掉wild type, 再
过表达mutant。没有CRISPR以前,这样做的文章还不少。 |
a*****n 发帖数: 2835 | 6 CRISPR很有用,但是感觉还没有能够取代RNAi
【在 D***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是不是现在有了CRISPR,还在用shRNA就已经过时了?比如我想干扰掉wild type, 再 : 过表达mutant。没有CRISPR以前,这样做的文章还不少。
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s******s 发帖数: 13035 | 7 两回事。crisper可以做homozygous mutant,也就是knockout;
RNAi这玩意儿更像hetreozygous mutation,knockdown
【在 a*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : CRISPR很有用,但是感觉还没有能够取代RNAi
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j****x 发帖数: 1704 | 8 尽管是两回事,但假如crisper做knockout能和RNAi做knockdown一样容易,那么的确可
以预计前者将会取代后者吧
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 两回事。crisper可以做homozygous mutant,也就是knockout; : RNAi这玩意儿更像hetreozygous mutation,knockdown
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s******s 发帖数: 13035 | 9 非也非也。要看实际情况是啥,你这个是基础科研思路,只要knockout就
最好。实际上,很多疾病并不是knockout的,而是dosage造成的问题,有
可能更加接近RNAi。
应该可以1:1混合正常crisper:不切crisper造成hetero解决部分问题,
不过RNAi也可以装到inducible上做更加精细的表达调控,所以我觉得
很多情况下RNAi还是有特有的优势的
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 尽管是两回事,但假如crisper做knockout能和RNAi做knockdown一样容易,那么的确可 : 以预计前者将会取代后者吧
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Z**********g 发帖数: 222 | 10 RNAi也有优点:可以inducible/reversible.
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 尽管是两回事,但假如crisper做knockout能和RNAi做knockdown一样容易,那么的确可 : 以预计前者将会取代后者吧
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z********8 发帖数: 818 | 11
有没有文献支持这个?
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我道听途说,只要能转进去,据说knockout接近100% : 我不负责是否正确
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j****x 发帖数: 1704 | 12 除非你要在你的模型上完全mimic不同dosage所造成的不同表型,否则我确实不认为
knockdown在这里相比knockout有什么更多的好处,何况你说的这个情况,也可以用
knockout+knockin来更好的实现。当然,我所说的前提目前不存在,所以也就无所谓取
代RNAi了
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非也非也。要看实际情况是啥,你这个是基础科研思路,只要knockout就 : 最好。实际上,很多疾病并不是knockout的,而是dosage造成的问题,有 : 可能更加接近RNAi。 : 应该可以1:1混合正常crisper:不切crisper造成hetero解决部分问题, : 不过RNAi也可以装到inducible上做更加精细的表达调控,所以我觉得 : 很多情况下RNAi还是有特有的优势的
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p*******r 发帖数: 59 | 13 谢谢大家的热情讨论,从Addgene订了Feng Zhang lab的 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)
和 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)plasmids. 打算先用最简单的 transfection 和
cutting cas9 看看结果怎么样. 不行得话再用nicking cas9 and lentivirus.
Welcome more discussions in the future. |
a***y 发帖数: 19743 | 14 本不需要做类似的东西
不过最近考虑下游实验可能需要做overexpression 的knock-in
这个技术也是适用的,对吧?
PX458)
【在 p*******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢大家的热情讨论,从Addgene订了Feng Zhang lab的 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) : 和 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)plasmids. 打算先用最简单的 transfection 和 : cutting cas9 看看结果怎么样. 不行得话再用nicking cas9 and lentivirus. : Welcome more discussions in the future.
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z*t 发帖数: 863 | 15 我们用32D细胞做indel,电转,addgene上的P458/459都试过。
电转效率比较低,2-3% GFP+,筛出single cell colony,里面8~9/10都有indel,不过
indel是相当heterogenous,几乎没有一样的。
puro因为电转效率太低,没有长起来。
【在 p*******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗? : Cutting cas9 的off-target 可能性大吗? : 293T细胞如果有90%的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有 : 多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做 : 一下预实验看看基因作用?像siRNA一样用? : 有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的? : Thanks!
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