w*****a
发帖数: 437 | 1 刚接触Lentivirus，啥都不懂，求大拿指点。
是这样，老板想看一个基因A在Smooth muscle cell differentiation里面的作用。手
上有个神经干细胞的cell line，加Tgfb后5-6天会变成SMC。
然后有前人留下来的overexpression A的lentivirus，和knockdown A的ShRNA
lentivirus，冻在-80,都大概有10多管15ml的virus。
老板想用virus overexpress 或 knockdown 基因A, 然后看differentiation pattern
有啥变化。可能用qPCR，RNA-seq啥的做readout。
本来想随便测个titer，把现有的virus加1ml到正differentiate的细胞里面（24 well)
，然后提个RNA就得了。后来一想，问题来了：
1）这神经干细胞特金贵，要特殊的medium养才成，我这virus supernatant加进去搞个
几天，还能活吗？更不提按正常程序differentiate了。那做出来的东西，不是非常的
artificial么？
2)要细胞长得好是不是得做inducible 的stable line，只需用doxycycline加在medium
里就行了。但做这个估计得1-2个月吧。
啰啰嗦嗦，其实就是怎么加virus会比较不影响细胞正常生长分化，又保证
transduction效率。。
谢谢~ |
m****e
发帖数: 173 | 2 lenti -80放多久了，超过两三个月，建议你重做一批。
你担心virus体积太大, 下次自己做的时候用超速离心机离下来，一个T75做的virus用
100ul MEM重悬，一个24 well加10ul virus足矣。 |
w*****a
发帖数: 437 | 3 谢谢！超速离心是个好办法，一般要多快离多久啊。
估计差不多2-3个月了，重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧？那不是得
好一阵子养了。。
一个双黄包聊表谢意~
【在 m****e 的大作中提到】
: lenti -80放多久了，超过两三个月，建议你重做一批。
: 你担心virus体积太大, 下次自己做的时候用超速离心机离下来，一个T75做的virus用
: 100ul MEM重悬，一个24 well加10ul virus足矣。
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a*******a
发帖数: 4233 | 4 可能需要浓缩然后换被感染细胞的培养基重悬
不然stem cell可能会分化
pattern
well)
【在 w*****a 的大作中提到】
: 刚接触Lentivirus，啥都不懂，求大拿指点。
: 是这样，老板想看一个基因A在Smooth muscle cell differentiation里面的作用。手
: 上有个神经干细胞的cell line，加Tgfb后5-6天会变成SMC。
: 然后有前人留下来的overexpression A的lentivirus，和knockdown A的ShRNA
: lentivirus，冻在-80,都大概有10多管15ml的virus。
: 老板想用virus overexpress 或 knockdown 基因A, 然后看differentiation pattern
: 有啥变化。可能用qPCR，RNA-seq啥的做readout。
: 本来想随便测个titer，把现有的virus加1ml到正differentiate的细胞里面（24 well)
: ，然后提个RNA就得了。后来一想，问题来了：
: 1）这神经干细胞特金贵，要特殊的medium养才成，我这virus supernatant加进去搞个
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d*****r
发帖数: 45 | 5 浓缩病毒可以用 PEG Virus Precipitation Kit，损失更小些
293T准备好了以后，做完transfection两三天就可以收病毒了，不用太久
【在 w*****a 的大作中提到】
: 谢谢！超速离心是个好办法，一般要多快离多久啊。
: 估计差不多2-3个月了，重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧？那不是得
: 好一阵子养了。。
: 一个双黄包聊表谢意~
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m****e
发帖数: 173 | 6 49,000 x g for 90 min
拿到hek，周一分细胞，周二transfection,周四离心，周五分装。然后就可以用了
【在 w*****a 的大作中提到】
: 谢谢！超速离心是个好办法，一般要多快离多久啊。
: 估计差不多2-3个月了，重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧？那不是得
: 好一阵子养了。。
: 一个双黄包聊表谢意~
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w*****a
发帖数: 437 | 7 谢谢楼上各位的回复！每人一个小笼包鼓励:-)
看来大家都觉得要重新做virus，那是不是要买lentiviral packaging kit来包装？哪
家的比较好用啊~
-80的virus，是不是可以浓缩以后试试，clontech有个浓缩病毒的kit不知好用不？ |
j****x
发帖数: 1704 | 8 更简单的办法是超滤浓缩，millipore的100K Ultra Centrifugal Filter，可以直接浓
缩100-200倍。
4质粒共转染293T/293FT细胞，隔天换液，3天后收上清，然后超滤浓缩，浓缩后的病毒
直接感染靶细胞，效果会比冻融之后的好几倍到一个数量级。
【在 w*****a 的大作中提到】
: 谢谢！超速离心是个好办法，一般要多快离多久啊。
: 估计差不多2-3个月了，重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧？那不是得
: 好一阵子养了。。
: 一个双黄包聊表谢意~
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w*****a
发帖数: 437 | 9 谢谢！
【在 j****x 的大作中提到】
: 更简单的办法是超滤浓缩，millipore的100K Ultra Centrifugal Filter，可以直接浓
: 缩100-200倍。
: 4质粒共转染293T/293FT细胞，隔天换液，3天后收上清，然后超滤浓缩，浓缩后的病毒
: 直接感染靶细胞，效果会比冻融之后的好几倍到一个数量级。
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f*******a
发帖数: 671 | 10 我们都放了好几年的还用呢。不过要重新做titer
【在 m****e 的大作中提到】
: lenti -80放多久了，超过两三个月，建议你重做一批。
: 你担心virus体积太大, 下次自己做的时候用超速离心机离下来，一个T75做的virus用
: 100ul MEM重悬，一个24 well加10ul virus足矣。
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w*****a
发帖数: 437 | 11 谢谢！请问用哪个titer kit做titer啊？
【在 f*******a 的大作中提到】
: 我们都放了好几年的还用呢。不过要重新做titer
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