H****s
发帖数: 301 | 1 从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
了。 |
X******n
发帖数: 914 | 2 你要改变你从酵母里面提质粒的方法，而不是细菌的转化方法。
加入P1buffer后一定要用beads打破酵母的细胞壁。 |
H****s
发帖数: 301 | 3 老大，我就是这么做的呀。
【在 X******n 的大作中提到】
: 你要改变你从酵母里面提质粒的方法，而不是细菌的转化方法。
: 加入P1buffer后一定要用beads打破酵母的细胞壁。
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X******n
发帖数: 914 | |
s********n
发帖数: 2939 | |
H****s
发帖数: 301 | 6 加了酸洗的玻璃珠和裂解液之后，在振荡器上自动振了10分钟（最大速度）。应该不存
在细胞壁破裂不够的问题。再说，用细胞壁破的不够，可以解释为什么化学转化不成功
（因为产量低）。但是没法子解释为什么菌落特别小呀。
老大，看来您是高手，能不能分享一下你的protocol？谢了。
【在 X******n 的大作中提到】
: 估计你细胞壁破的不够。
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H****s
发帖数: 301 | 7 这不是好奇吗。越想越觉得好奇。查了文献，有的文献里提到了这么一两句，但是不足
以解决心里的疑问。
【在 s********n 的大作中提到】
: 用电转也没啥不好的吧？
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s********n
发帖数: 2939 | 8 E. coli的菌落小？
【在 H****s 的大作中提到】
: 加了酸洗的玻璃珠和裂解液之后，在振荡器上自动振了10分钟（最大速度）。应该不存
: 在细胞壁破裂不够的问题。再说，用细胞壁破的不够，可以解释为什么化学转化不成功
: （因为产量低）。但是没法子解释为什么菌落特别小呀。
: 老大，看来您是高手，能不能分享一下你的protocol？谢了。
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w******y
发帖数: 6 | 9 从酵母里提的质粒一般量比较低，所以要用高效率的感受态细胞，用top10转效果比较
好。
【在 H****s 的大作中提到】
: 从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
: 落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
: 了。
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s******r
发帖数: 1245 | 10 小菌落里的质粒弄出来看看还对不对，可能质粒在酵母里吧e coli的origin抗性啥的弄
丢了
【在 H****s 的大作中提到】
: 从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
: 落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
: 了。
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j****n
发帖数: 3370 | 11 我们实验室就是做酵母的
这个问题经常发现
刚开始怀疑是目标蛋白对 e coli有毒性 很多yeast promoter在e coli都有不同程度的
活性
后来发现即使有stop codon mutation的 也存在相同问题
共同的结果就是过夜抽提得到plasmid 浓度非常低 经常低于50 ng/ul
至于原因不清楚
目前
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 H****s 的大作中提到】
: 从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
: 落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
: 了。
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j****n
发帖数: 3370 | 12 我们试过不少方法，有些效果比较明显
1 NEB turbo比top 10好 然后比dh5a好
2 可以试试用30甚至更低的温度，包括recover，inoculation, and liquid culture
Good luck
我最感兴趣的还是这个原因。老板说是所谓的toxic dna，就是plasmid dna形成某种特
殊的结构，然后形成 e coli toxicity 不过没看过这方便的文章。苦于没时间做更深
入的研究。。。
欢迎高手指点。。。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 j****n 的大作中提到】
: 我们实验室就是做酵母的
: 这个问题经常发现
: 刚开始怀疑是目标蛋白对 e coli有毒性 很多yeast promoter在e coli都有不同程度的
: 活性
: 后来发现即使有stop codon mutation的 也存在相同问题
: 共同的结果就是过夜抽提得到plasmid 浓度非常低 经常低于50 ng/ul
: 至于原因不清楚
: 目前
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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j****n
发帖数: 3370 | 13 应该不是转化方法的问题
20k以下的plasmid 电转/热转区别不明显
30k以上的貌似要电转？至少我没做出来过，哈哈 毕竟yeast抽出来plasmid 质量太差
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 H****s 的大作中提到】
: 从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
: 落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
: 了。
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s********x
发帖数: 472 | 14 菌落小肯定是毒性问题，和dna量没关系。
换载体或者换个酵母治理试试。 |
H****s
发帖数: 301 | 15 小菌落都是对的，和抗性丢失没有什么关系。
【在 s******r 的大作中提到】
: 小菌落里的质粒弄出来看看还对不对，可能质粒在酵母里吧e coli的origin抗性啥的弄
: 丢了
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H****s
发帖数: 301 | 16 转化过夜生长后，菌落在平板上如针尖大小，长24小时，菌落形态也很小。
【在 s********n 的大作中提到】
: E. coli的菌落小？
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H****s
发帖数: 301 | 17 握手。
toxic dna这个假设我在一篇文献里面看到过，只是说有可能是酵母genomic DNA所带来
的毒性。没有看到什么实验证据。
【在 j****n 的大作中提到】
: 我们试过不少方法，有些效果比较明显
: 1 NEB turbo比top 10好 然后比dh5a好
: 2 可以试试用30甚至更低的温度，包括recover，inoculation, and liquid culture
: Good luck
: 我最感兴趣的还是这个原因。老板说是所谓的toxic dna，就是plasmid dna形成某种特
: 殊的结构，然后形成 e coli toxicity 不过没看过这方便的文章。苦于没时间做更深
: 入的研究。。。
: 欢迎高手指点。。。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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H****s
发帖数: 301 | 18 应该和载体没有关系，因为转到细菌里后从细菌里小提的质粒就没有这个现象了，肯定
和酵母有关。
【在 s********x 的大作中提到】
: 菌落小肯定是毒性问题，和dna量没关系。
: 换载体或者换个酵母治理试试。
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h**********r
发帖数: 671 | 19 我是门外汉。很有意思的现象。质粒DNA被酵母修饰了？ |
