p*****c
发帖数: 116 | 1 求救：
我手里的课题，现已证明两个蛋白interaction is dependent on DNA?
是不是这个课题就死了？
是不是就没有必要往下做了？
非常感谢！！！ |
r*******y
发帖数: 48 | 2 Interestingly. Depending on how they interaction relies on DNA.
BTw, how did you get this conclusion? they did not have any physical
association in pulldown assay? |
p*****c
发帖数: 116 | 3 谢谢你的回复，有physical interaction in IP, 但是在cell lysates 中加了DNase后
， interaction就很弱了，基本上就没有了。
能看到功能上相关的地方。不知道下一步该往哪儿走了？迷茫的很。 |
r*******y
发帖数: 48 | 4 To go further, you need to first confirn your current findings in different
ways. Some suggestions:
1. Do GST pulldown, to make sure there is little or no direct interaction
between them in vitro;
2. consider if the addition of DNase, which is also a protein, will directly
interfere with the physical association between these two proteins. In
other words, if DNase reduces the physical association only via chromatin/
DNA degradation but not other ways.
if you confirm that these two proteins are physically associated via
chromatin, then you will need to think about continuing this project. the
following are a number of examples:
1. One, or both of these two proteins, are transcripotion factors? if yes,
what is the binding sequence and where?
2. does they form ternary complex on one of the DNA bind elements?
3. Knockdown one of transcription factor will reduce DNA binding of the
other? |
p*****c
发帖数: 116 | 5 非常感谢你的指导：
两个蛋白都不是transcription factor，但是其中一个有报道可以识别sequence
specific DNA motif by a zinc finger protein。敲除之后，能看到另一个蛋白DNA
binding显著增高了。
chromatin fraction IP显示两个蛋白是在chromatin上相互作用。有没有相关的文献推
荐几篇给我？ 我找了挺久的，都没找着。
Ternary complex 不知道怎么检测？ |
r*******y
发帖数: 48 | 6 1. 两个蛋白都不是transcription factor，但是其中一个有报道可以识别sequence
specific DNA motif by a zinc finger protein。
Do you mean it recognizes DNA motif by a zinc finger domain?
2. 敲除之后，能看到另一个蛋白DNA binding显著增高了。
taken 1&2, it suggests that 1) the other protein is also able to bind DNA, 2
) the presence of the protein mentioned in "1" inhibited the DNA binding of
the other protein.
3. chromatin fraction IP显示两个蛋白是在chromatin上相互作用。
Regular ChIP does not tell you that these proteins interact on chromatin; it
only tells that both proteins bind to the same or similar region of
chromatin;
4. Ternary complex 不知道怎么检测？
EMSA can be used to test ternary complex formation.
Based on these results, I believe that you do not have a strong argument
that these two proteins physically interact relying on chromatin. You need
more compelling data. |
s******y
发帖数: 28562 | 7 这两个蛋白能够纯化出来么？如果能的话，把它们和DNA 放到一起看看他们是否能够形
成复合体（这个有很多种方法可以检验，比方说把DNA连接在agarose 上)
如果单独是DNA 不行的话，那么就看看是不是需要核蛋白，你可以把纯化出来的核小体
进去。
当然，最重要的是，既然你们有KO cell,那么你们应该试图看看这些蛋白是干什么功能
的。
【在 p*****c 的大作中提到】
: 非常感谢你的指导：
: 两个蛋白都不是transcription factor，但是其中一个有报道可以识别sequence
: specific DNA motif by a zinc finger protein。敲除之后，能看到另一个蛋白DNA
: binding显著增高了。
: chromatin fraction IP显示两个蛋白是在chromatin上相互作用。有没有相关的文献推
: 荐几篇给我？ 我找了挺久的，都没找着。
: Ternary complex 不知道怎么检测？
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p*****c
发帖数: 116 | 8 非常感谢你的建议！
是的，两个组独立做出来的。
3. chromatin fraction IP显示两个蛋白是在chromatin上相互作用。
Regular ChIP does not tell you that these proteins interact on chromatin; it
only tells that both proteins bind to the same or similar region of
chromatin;
我是isolate细胞的chromatin组分做的IP。如果证据不充分的话，是不是必须要做
Sunnday建议的体外reconstitution的实验才可以？ |
p*****c
发帖数: 116 | 9
谢谢你的评论！ 这些蛋白的功能有一点初步的结果，还挺有意思的。如果蛋白的相互
作用是成立的话，就可以有些机理上的数据了。你建议的这个实验很有意思，我会试一
试。
【在 s******y 的大作中提到】
: 这两个蛋白能够纯化出来么？如果能的话，把它们和DNA 放到一起看看他们是否能够形
: 成复合体（这个有很多种方法可以检验，比方说把DNA连接在agarose 上)
: 如果单独是DNA 不行的话，那么就看看是不是需要核蛋白，你可以把纯化出来的核小体
: 进去。
: 当然，最重要的是，既然你们有KO cell,那么你们应该试图看看这些蛋白是干什么功能
: 的。
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k*****n
发帖数: 323 | |
p*****c
发帖数: 116 | 11
是不是序列特异性的哇？
是的。
【在 k*****n 的大作中提到】
: 是不是序列特异性的哇？
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k*****n
发帖数: 323 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 13 might has seesaw model too?
pls refer Tang C and Deng HK
their Cell paper:
同主题阅读：细胞命运，系于“跷跷板”？
[版面:中国科学技术大学][首篇作者：joeliu] , 2013年05月30日
http://www.mitbbs.com/article_t/USTC/31190059.html
【在 k*****n 的大作中提到】
: 很有意思哇，貌似像个负反馈调控啊
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